183064. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagokat tartalmazó folyadákok komponenseinek szétválasztására és elemzésére
1 183 064 2 95 % 02 + 5 % C02 gázkeverékkel folyamatosan átbuborékoltatott 37 °C-on termosztált 1,5 ml térfogatú rendszerben vizsgáltuk. A simaizom készítmények akiivitását elektromos erőátalakító (Bioforcemeter BFS 8) segítségével, izometriásan mértük és regisztráltuk (II detektor). dj Eredmények* A tengerimalac izolált méhszarvcsík készítményt egyaránt kontrakcióra bíró három ismert tesztanyag közül a bradikinin (BR) 0,79, az oxitocin (OX) 0,91, a prostaglandin F2a (FG) pedig 1,35 Kav értékeknél eluálódott. (4. ábra). A 4. ábrán az OX jelzés oxitocint, a PG jelzés prostaglandint, a BR jelzés bradikinint jelöl. A Kav értékek alapján nyilvánvaló, hogy a bradikinin és az oxitocin a géloszlopnak nagyjából a molekulaméret szerinti eloszlást biztosító térfogatában (Kav < 1,00), a prostaglandin F2a viszont ennél nagyobb térfogatban (Kav > 1,00) oszlik meg. Az egészséges nőtől nyert" vizelet butanolos kivonatában összesen négy olyan, azi'bszlop^ effektiv permeációs' térfogatában megoszló frakció '/olt kimutatható, melyék a tengerimalac izolált méhszarvcsík készítményen kontrakciót váltottak ki. (5. ábra). Közülük a 0,38 Kav értéknél eluálódó frakció a tengerimalac vékonybél készítményen is összehúzódást okózott (6. ábra). Két másik, 0,61, illetve1'íf,4'j Kav értéknél eluálható frakció kizárólag a tengerimalat rritéhszarvcsík kontrakcióját okozta és hatástalan volt a másik két simaizom-készítményen. Végül a negyedik, 0,98 Kav értéknél eluálódó frakció a méhszarvcsík kontrakcióját (5. ábra) és az ileum hoszszanti izomkészítmény ellazulását (6. ábra) hozta létre. * A 3. ábrán látható, hogy az analizált női vizelet butanolos kivonatának frakcionálását követően végzett optikai regisztrálás frakcionálási nem jelez. A vizsgált női vizelet butanolos extraktumában további négy olyan frakciót is találtunk, amelyek valamennyien hatást gyakoroltak a patkány izolált duodenum készítményre (7. ábra). Közülük három (K® = = 0,05, 0,19, és 0,28) kizárólag az izolált duodenum készítményen volt hatásos a Kav = 0,05 frakció a szerv relaxációját, a Kav = 0,19 és a Kav = 0,28 frakciók pedig a szerv tartós kontrakcióját váltották ki. A negyedik frakció (Kav = 0,48) miközben a patkány duodenum készítményt relaxálta (7. ábra), a tengerimalac vékonybél hosszanti izom preparátum kontrakcióját (6. ábra) váltotta ki. Az analizált női vizelet butanolos kivonata a már ismertetett nyolc frakción kívül egy, az oszlopon adszorbeálódó (Kav = 1,60) és kizárólag az izolált patkány duodenumot kontraháló frakciót is tartalmazott (7. ábra). A női vizelet butanolos kivonatából szeparált, Kav értékük szerint sorrendbe állított frakciók biológiai hatásait összesítőén az I. táblázatban mutatjuk be. I. táblázat tengerimalac patkány ismeretlen komponens 0,05 0 0 — ismeretlen komponens 0,19 0 0 + ismeretlen komponens 0,28 0 0 + ismeretlen komponens 0,38 + + 0 ismeretlen komponens 0,48 0 + . _ ismeretlen komponens 0,61 + 0 0 ismeretlen komponens 0,71 + * 0 0 bradikinin 0,79 + ■ +oxitocin 0,91 + 0 0 ismeretlen komponens 0,98 +-0 . prostagl. F 2 ismeretlen komponens 1,35 + _L 4-1 60 0 ’0 + + = biológiai aktivitás növekedés - = biológiai aktivitás csökkenése 0 — hatástalan 2. példa Minta előkészítése a) Krónikus veseelégtelenségben szenvedő, krónikus művesekezelésre beállított beteg vér-ultraszűrletét (HUF) —20 °C-on tároltuk. A-felhasználás előtt UM 05 membránon végeztünk ultraszűrést. (Amicon cella, 4 atm. N2:,1 4 °C):1 * - - ‘ b) Egészséges emberi terhesség 8. hetében végzett műszeres terhességmegszakítás során nyert boholyszövetet ollóval aprítottunk, majd 10 g-ját 100 ml deíonizált vízben homogenizáltuk (Blendor, 20 000 rpm, 2 perc, 2 °C). A centrifugálás (Beckmann, 20 000 rpm, 30 perc, 2 °C) után nyert felülúszót -vattán szűrtük, ilymódon a lipid réteget eltávolítottuk. A kivonatot kimerítő ultraszűrésnek vetettük alá (TMC 10 rendszer, 2 atm N2, 2 °C): először PM 10 szűrőn, majd a szűrletet AM 5 szűrőn, végül az YM 5 szűrletet UM 02 szűrőn. A szűrőn visszamaradó anyagokat (névleges molekulatömege: 1000 és 5000 D között) liofilizáltuk, majd felhasználás előtt 0,8 ml desztillált vízben feloldottuk. A bioszeparációs-biodetekciós rendszer egységei A 2. példa esetében: Szeparáló egység: Krebs oldattal egyensúlyba hozott Sephadex G-25 fine (SG 25) géllel töltött oszlop (1,6X39). Az eluálást szobahőmérsékleten Krebs oldattal 0,50 ± 0,05 ml/perc átfolyás mellett (Perpex pumpa) végeztük. Az eluátum optikai tulajdonságát Uvicord (LKB) készülékkel folyamatosan mértük 280 nm hullámhosszon. A minta térfogata: 10,0 ml HUF és 0,8 ml szövetkivonat. Az oszlopot előzőleg acetonnal, nátrium-hidroxid-oldattal, karbamiddal és színezett dextrán oldattal kalibráltuk. (Vt/V0 = 3,3, ahol Vt = az oszlop teljes térfogat a geometriai paraméterek alapján számítva, V0 = Blue dextran (színezett dextran) eluciós térfogata). b) Biodetekciós egység: 1,25 ml térfogatú, 37 °C-on tartott szervfürdő edény, az Üvicord készülékből folyamatosan kiáramló eluátummal átáramoltatva, karbogén segítségével oxigénnel ellátva. Izolált szerv: östrogénnel (50 ug Akrofollin se. 24 órával leölés előtt) kezelt 120 g-os, szűz, beltenyészetű fehér patkány méhszarvából készült (12X2 mm-es) csík, amelynek összehúzódá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
