183019. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-andraösztén-17-on származékok előállítására
! 183 Ol'I 2 a maximális szubszlráium-átalakulás eléréséig folytatjuk a fermentálást. Alkalmas szubsztrátum-oldószer például a metanol, etanol, glikol-monometil-éter, dimetil-formamid vagy dimetil-szulfoxid. A szubsztrátumot például úgy etnulgeálhatjuk, hogy mikronizált formában vagy vízzel elegyedő oldószerben (mint metanolban, etanolban, acetonban, glikol-monometil-éterben, dimetil-formamidban vagy dimetil-szulfoxidban) oldva, erős turbulencia fenntartása közben előnyösen mésztelenített és szokásos emulgeátorokat tartalmazó vízhez keverjük hozzá. Alkalmas emulgeátorok, a nem-ionogén emulgeátorok, mint például etilén -oxid-adduktumok vagy poliglikolok zsírsav-észterei. Előnyös emulgeátorok például a kereskedésbeli nedvesítőszerek, mint a Tegin®, Tagat®, Tween® és a Span®. Különösen a (II) általános képletű 3-alkoxi-vegyületek fermentálása esetén érhető el a szubsztrátum emulgeálásával nagyobb szubsztrátum-koncentráció. A találmány szerinti eljárásnál természetesen más, a fermentációs szakember számára ismert egyéb módszerek is alkalmazhatók a szubsztrátum-koncentrációjának növelésére. Az optimális szubsztrátum-koncentráció, szubsztrátum-adagolási idő és fermentációs időtartam a használt szubsztrátum szerkezetétől és az alkalmazott mikroorganizmus jellegétől függ. Ezeket az értékeket - amint ez mikrobiológiai szteroid átalakításoknál általában szükséges - minden esetben a szakember számára közismert előkísérletekkel kell meghatározni. Az (I) általános képletű S-androszten-17-on-származékok, amelyekben R, és R2 rövidszénláncű alkilén-dioxicsoportot jelent, nehézség nélkül alakíthatók át farmakológiailag aktív szleroidokká Így például e vegyületek ketálcsoportját - adott esetben a ketocsoport nátriumbór-hidriddel történő redukálása után - savval hidrolitikusan lehasíthatjuk és így ismert szteroidokat, 4-androsztén-3,17-diont és tesztoszteront kapunk. A kiindulóanyagokként használt(lI)általános képletű 3-aIkoxi-vegyületek a megfelelő 3-hidroxi-vegyüIetekből állíthatók elő például J. P. Duszo és munkatársai eljárásával (Steroids 1966, 495-509) olyan módon, hogy az utóbbi vegyületeket trialkil-ortohangyasav-észterekkel reagáltatjuk perklórsav jelenlétében. A kiindulóanyagokként használt (II) általános képletű 3-ketálok a 3-hidroxi-vegyületekből állíthatók elő ügy. hogy azokat például Oppenauer-eljárással oxidáljuk és a képződött 3-keto-A4 -szteroidokat alkándiolokkal p-toluolszulfonsav jelenlétében ketálozzuk (C. Djerassi: Steroid Reactions, Holden Day Inc., San Francisco 1963, 3-8. és 92-101. oldal). A következő példák a találmány megvilágítására szolgálnak. 1. példa a) 2 literes Erlenmeyer-lombikba betöltünk 1% élesztő-kivonatot, 0,45% dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,34% kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,2% Tween 80-at tartalmazó, pH 6,7-re beállított 500 ml steril tápoldatot, beoltjuk Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 száraz tenyészetével és 3 napig percenkénti 190 fordulattal 30 6C-on rázatjuk. b) 50 g koleszterint 120 ml diklór-metánban és 50 ml ortohangyasav-trietil-észterben szuszpendálunk argongáz ;.linoszférában. hozzáadunk 0,5 ml 70%-os perklórsav,ii és 4 óráig szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a keve tekét vízbe öntjük. 2 óráig keverjük, diklór-metánna! exlraháljuk, a diklór-metán-fázist mossuk, vákuumban bepároljuk, a maradékot metanolból kristályosítjuk: 43,25 g 82--83 °C olvadáspont 30-etoxi-5-koleszténi kapunk. A kapott 3-eto.xi-5-koleszlén 25,0 g-ját 10 g Teginnel® és nátriumhidroxid-oldattal pH 11,3-ra beállított 750 ml vízzel 95 °C-on Ultra-Turrax® készülék (Jahnke és Kungel cég, NSZK) segítségével 5 percig emulgeáljuk \z emulziót 20 percig 120 °C-on sterilezzük. c) 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba betöltjük 2,0% kukorica-lekvárt, 0,3% diammónium-hidrogén-foszfátot és 0,25% Tween 80-at tartalmazó, pH 7-re beállított 85 ml steril tápoldatot, beoltjuk a Mycobacterium spec, előtenyészet 5 ml-ével, hozzáadunk 14 ml 3ß-etoxi-5- kolesztén-szuszpenziót (megfelel 0,5 g 3-etoxi-5-koleszténnek) és 120 óráig percenkénti 220 fordulattal 30 °C- on rázatjuk. Ezután a fermentációs tenyészetet tetraklór-etánnal extraháljuk, a szerves fázist mosás után bepároljuk, a maradékot szilikagéloszlopon kromatografáljuk és 0,025 g 3-etoxi-5-kolesztén mellett — etil-acetátból való átkristályosítás után - 0,25 g 146-147 °C olvadáspontú 3/?-etoxi-5-androszten-l7-ont kapunk. 2. példa a) 50 g sztigmaszterin nyersterméket az lb) példában leírt körülmények között 30-etil-éterré alakítunk át. A kapott 30-etoxi sztigmaszterin nyerstermék (92% tisztaságú) 25,0 g-ját az lb) példában leírt módon emulgeáljuk. b) Az előállított 3j3-etoxi-sztigmaszterin szuszpenzió 14 mi ét (megfelel 0,46 g 3-etoxi-sztigmaszterinnek) az le) példában leírt körülmények között 120 óráig Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 kultúrával fermentáljuk és az le) példában leírt feldolgozás után 0,1 g 3ß-etoxisztigmaszterint és 0,18 g 146-147 C olvadáspontú 3 0-e toxi-5 -androsztén-17-ont kapunk 3. példa a) 25 g 4-koleszten-3-omhoz 150 ml benzolt, 30 g glikolt és 0,5 g p-toluolszulfonsavat adunk és 24 óráig vízleválasztó alkalmazásával melegítjük. Ezután a keveréket lehűlni hagyjuk, benzollal hígítjuk, benzolos fázist nátrium-hidrogén-karbonáttal és vízzel mossuk, nátrium-szulfát felett szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot aceton/hexánból átkristályosítva 19,6 g 130-132 °C-on olvadó 3,3-etilén-dioxi-5-kolesztént kapunk. 5 g 3,3-etilén-dioxi-5-kolesztént 60°C-on 100 ml dimetil-formamidban oldunk. b) Az le) példában leírt körülmények között 100 ml Mycobacterium spec. NRRL-B-3085 tenyészetet állítunk elő, hozzáadunk 1 ml 3,3-etilén-dioxi-5-koIesztén oldatot és 96 óráig fermentáljuk. A fermentációs keveréket az le) példában leírt módon feldolgozzuk és 0,01 g 3,3-etilén-dioxi-5-kolesztcn mellett 0,013 g 164-165 °C olvadáspontú 3,3-etilcn-dioxi-5-androszten-17-ont kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
