182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 997 2 tartalmazza. A vesikulum képződésénél a lipidet szuszpendálva tartalmazó oldatot magába zárja. /. táblázat Lipid-vesikulum összetétele* Mólaiány PC Vesikulum PS : CH VI 9 : 1 : 8 V2 8 : 2 : 7 V3 8 : 4 7 V4 8 : 0 7 * = használható mólarány-tartomány (VI V3) PC: PS : CH = 10—5 : 4—1 : 10-3. A foszfatidil-szerint szarvasmarha agyveló'ből (Kocs- Light, Nagybritannia) és a foszfatidil-kolint tojássárgából (Lipid Specialities, Boston, USA) állítjuk elő. A koleszterint és az izonit-hexafoszfát nátriumsót a Merck (Darmstadt), illetve a Sigma (München) cégtől szereztük be. Az összes lipidet oszlopkromatográfiás úton tisztítottuk és tisztaságukat vékony rétegkromatográfiával ellenőriztük. In mól/1 lipidből 2 • 10*1 lipid-vesikulumot nyerünk, melyek kettős rétegű lipid-membránnal vannak ellátva (500 A vagy kisebb átmérőjű vesikulumok). 2 • 10‘ 1 lipid-vesikulumot 106 eritrocitával inkubálunk; az eljárás során azonban az alábbiakban ismertetésre kerülő más körülményeket is alkalmazunk. Inozit-hexafoszfát beépítése emberi eritrocitdkba ln vitro kísérletekhez 200 p] eritrocita-szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 percen át 8000 g-el centrifugálunk (Eppendorf-centrifuga 3200 típusú, percenként 12 000 fordulat). A szedimentált sejteket szükség esetén a fenti módon mossuk és a kívánt pH-értékre beállítjuk, majd ismét 200 jul izotóniás 0,1 mólos kívánt pH-értékű pufferben szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz azonos térfogatú kívánt pH-értékű lipid-vesikulum-szuszpenziót adunk. Az eritrocitákat 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az eritrocitákat ezután 0,1 mólos izotóniás pufferrel állandó pH-érték eléréséig többször mossuk. A felül elhelyezkedő résszel lecsapási kísérleteket végzünk (kalcium kationokkal), míg szabad IHP már nem mutatható ki. Az eljárásnál a pH=7—8 tartományban hatékony és az eritrociták kifogástalan szerkezeti morfológiai és funkcionális tulajdonságait nem befolyásoló bármely puffer-rendszert felhasználhatunk. Az oxigén-megkötési görbe mérése Az oxigén-megkötési görbéket 25 °C-on gyors diffúziós módszerekkel vesszük fel [Sick H. ésGersonde K. Analyt. Biochem. 32 (1969) 362-376 és Sick H. és Gersonde K. 47 (1972) 46-56], Eredmények Tárolt emberi vörös vérsejtek Bohr-effektusa vesikulummal való egyesülése után A 40 napon át pH=7,4 értékű izotóniás pufferben 4 °C-on tartott és polifoszfátban részben elszegényedett emberi eritrociták oxigén-féltelítettségi nyomása (n—2,8) és Bohr-effektusa pH=7,6 értékű izotóniás pufferben 37 °C-on V2 vesikulummal 1 órán át történő inkubálás után lényegesen nem változik. Az eritrociták különböző lipid-összetételű vesikulumokkal (VI és V3) történő inkubálása sem befolyásolja az eritrociták hemoglobinjának oxigén-megkötési paramétereit. Tárolt emberi vörös vérsejtek Bohr-effektusa V2 vesikulummal közvetített inozit-hexafoszfát beépítés után Az IHP - a mind ez ideig ismert legerősebb Hb alloszterikus effektor — csökkenti a Hb oxigén-affinitását. mint azt az oxigénmegkötési görbe .jobbra tolódása” jelzi. Az IHP szintetizálására képtelen emberi eritrociták a fenti effektort tartalmazó lipid-vesikulumokkal való fúzió alatt ezzel a polifoszfáttal feltölthetők. A korábbiakban az IHP beépítésével kapcsolatban ismertetett találmányunk szerinti kísérleteket az alábbiakban felsorolt, az eritrocita-membránokon való áthatolásra képtelen alloszterikus effektorokkal és keveré- 1 eikkel hasonló eredményekkel végeztük el. A fenti típusú alloszterikus effektorokat pl. cukorfoszfátok (mint pl. inozit-pentafoszfát, inozit-tetrafoszfát, inozit-trifoszfát, inozit-difoszfát és difiszfatidil-inoí it-difoszfát) alkalmazhatók. Ezen kívül polifoszfátok (pl. nukleotid-trifoszfátok, nukleotid-difoszfátok, nukleotid-monofoszfátok és alkohol-foszfátészterek) alkalmazhatók. Továbbá szervetlen anionokat (pl. hexacianoferrát, foszfát és klorid) használhatók. Végül - különösen mutációnak alávetett Hb-oknál — alloszterikus < ffektorként szerves anionokat (pl. polikarbonsavakat) használhatunk. A mutált Hb-ok közül a „Zürich-Hemoglobint” és a polikarbonsavak példájaként a maleinsavat említjük meg. A 25 napon át 4°C-on 7,4 pH-értékű izotóniás puffer-közegben tartott emberi eritrocitákat (Pq2(1/2) — 6,0 Torr) pH=7,6 értékre állítunk be (Po2(l/2)=4,5 Torr), majd l órán át 37 °-on 0,1 mólos pH=7,6 értékű 0,19 mól) IHP tartalmú izotóniás trisz-pufferrel inozitbexafoszfáttal töltött V2 vesikulumokkal inkubáljuk. \z inozit-hexafoszfátnak az eritrocitákba való beépülése rtán az oxigén-féltelítettségi nyomás (Pq2( 1/2) = 14,3 Torr) 3,2 faktorral drasztikusan emelkedik és a friss f ritrocitákra jellemző (Po'2(l/2)=10,55 Torr) 1,4-es faktorral meghaladja. Ezután az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrocitákat ”,6 pH-jú izotóniás puffer-közegben 6 napon át 4 °C-on állni hagyjuk. A féltelítettségi nyomás állandó marad. További 4 napon át 4 °C-on való állás után az inozithexafoszfáttal töltött eritrociták pH-ját 7,28-ra változatjuk, mikor is a Poj(l/2) érték ismét 32,1 Torr-ra emelkedik. További kísérleteknél 36 napon át 4 °C-on tartott (DPG-ben jobban elszegényedett) mosott eritrocitákat 7,6 pH-értékre beállítunk és a fentiekben leírt módon inozit-hexafoszfátot építünk be. A Pq2(1/2) ez esetben is 14,0 Torr-ra emelkedik. Az inozit-hexafoszfáttal töltött sejteket 2 napon át 37 °C-on tartjuk. Az inozit-hexafoszfáttal töltött sejteket 2 napon át 37 °C-on tárolva az oxigénhez való affinitás ez esetben sem változik meg. Normál eritrocitákkal ellentétben — melyeknél a 4 °C-on való tárolás alatt a fiziológiai polifoszfátok leadása a felére csökken — az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrociták az inozit-hexafoszfátot legalább a 9 napos időtartam alatt nem hidrolizálják, amit konstans Pq2(1/2) érték mutat (lásd 5. ábra). Az ily módon kezelt eritrocitákkal lényegesen hosszabb konzerválási idő érhető el. Ebből következik, hogy' az inozit-hexafoszfáttal töltött vörös vérsejtek erősebb Bohr-effektust mutatnak, mint a kezeletlen sejtek (lásd 6. ábra). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
