182981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz koncentrátum előállítására mosóporhoz
1 182 981 2 Molekulasúly Az aminosav-összetételt jelző adatok arra mutatnak, hogy a C komponens és a szubtilizin molekulasúlya azonos nagyságrendű (ez utóbbira az irodalmi adat közelítőleg 27 300). Gátldsi vizsgálatok A szubtilizinnel ellentétben a C komponenst nem gátolják foszforilező szerek, például diizopropil-foszfofluoridát (DFP) vagy a fenil-metán-szulfonil-fluorid (PMSF). E megfigyelések alapján úgy tűnik, hogy a C komponens nem szerin-proteáz. Továbbá az a megfigyelés, hogy a C komponenst nem gátolják kelátképző szerek, például etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), azt mutatja, hogy nem fémtartalmú proteáz. A pH hatása a stabilitásra A C komponensnek kisebb a stabilitása mint a szubtiliziné a 9—10 közötti pH-tartományban, amely a mosóoldatok szokásos pH-értékének felel meg. Nyilvánvalóan - legalább is részben - ez az oka annak, hogy a C komponens mosószerenzim tulajdonságai lényegesen rosszabbak a szubtilizin ilyen jellegű tulajdonságainál. Az allergia vizsgálata IgE-antitestek képződése nyulaknál 24—24 nyúlból álló csoportoknak szubkután befecskendeztünk 0,5 ml szubtilizin-oldatot (15,1% fehérje nitrogéntartalom), illetve 0,5 ml C komponens-oldatot (13,7% fehéije nitrogéntartalom). Adjuvánsként Alhydrogelt alkalmaztunk (0,5 ml 1,3%-os emulzió, aluminiumoxidként számolva; gyártó Superfos, Koppenhága). Mindkét, összehasonlítani kívánt immunogén anyagból alkalmazott — mikrogramm fehérje nitrogéntartalom dimenzióban kifejezett — dózis azonos volt. Három különféle dózisnál — 0,015, 0,15 és 1,5 mikrogramm fehérje nitrogéntartalom — végeztünk összehasonlításokat. Az állatoktól vért vettünk az első immunizálást követő 13. napon, majd másnap újra immunizáltuk őket. Ezt az eljárást minden 14. napon megismételtük a 139 napból álló kísérleti időszak alatt. Passzív kután anafilaxis vizsgálat (PCA) A vizsgálatot N. J. Zvaifler és munkatársai módszerével végeztük [Journal of Experimental Medicine, 130, 907 (1969)). 2500 g körüli súlyú nyulak frissen leborotvált hátába intradermális befecskendezéssel 0,2 ml szérumot vagy hígított szérumot adtunk be. Három párhuzamos kísérletet végeztünk. 72 órás érzékenyítési időszak után az állatoknak antigént fecskendeztünk be intravénásán. A befecskendezett 5 ml séoldat 750 mikrogramm fehérje nitrogéntartalomnak megfelelő mennyiségű antigént és 50 mg Ewans Blue festéket (gyártó Merck) tartalmazott. 30—60 perc elteltével az állatokat feláldoztuk nagy dózisú Nembutal segítségével, majd mértük és feljegyeztük az elváltozásokat. 0,15 mikrogramm dózis esetén a C komponensre kapott pozitív titer lényegesen korábban és lényegesen több állatnál jelent meg, mint a szubtilizinre vonatkozólag. Ugyanennél a dózisértéknél a C komponens segítségével kiváltott titerértékek összege, 10 vérvétel során, szignifikánsan nagyobb volt, mint a szubtilizinnél (p<0,02). Módosított Anson-hemoglobin módszer a proteolitikus aktivitás meghatározására A proteolitikus aktivitás meghatározására szolgáló Anson-hemoglobin módszer alkalmazásakor denaturált hemoglobint tárunk fel standard körülmények között. A feltáratlan hemoglobint triklórecetsawal kicsapjuk, és a triklórecetsavban oldható termék mennyiségét Folin- Ciocalteu-féle fenol reagenssel határozzuk meg. Egy Anson egység (AU) az az enzimmennyiség, amely standard reakciókörülmények között olyan kezdeti sebességgel tárja fel a hemoglobint, hogy az 1 perc alatt felszabaduló, triklórecetsavban oldódó termék ugyanolyan színreakciót ad a fenol reagenssel, mint egy müliekvivalens tirozin. A standard reakciókörülmények a következők: hőmérséklet 25 °C; reakcióidő 10 perc; pH 7,5. A vonatkozó irodalmi helyek az alábbiak: M. L. Anson, Journal of General Physiology, 22, 79—89 (1939); O. Folin és V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry, 73, 627—636(1927). A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük: 1. példa A Bacillus licheniformis NRRL B-11301, B-11302 és B—11303 törzseket az alábbi körülmények között tenyésztjük: 500 ml-es Erlenmeyer lombikokba 100 ml táptalajt teszünk. A táptalajok összetételét a következő táblázat tartalmazza: 1. táptalaj 2. táptalaj 3. táptalaj vegyes % vegyes % vegyes % Burgonyake ményí tó 10 12,5 10 Szójabab liszt 5 7,5 2 Na2 HP04 • 12Hj O Pluroníc L-61 (nemionos 1 0,5 1 felületaktív anyag, gyártó Wyandotte Corp.) Tween 80 (polio xietilénszorbitán-monooleát, gyártó Atlas Chemical 0,01 0,01 0,01 Industries) Árpakeményító' 1 5 Nátrium-kazeinát BAN 120 L (Bacillus subtilis fermentálásával 1 nyert kereskedelmi alfa-amiláz, gyártó NOVO 1NDUSTRI) 0,01 0,01 0,01 A táptalajokat a lombikokban 50 °C-ról 90 °C-ra melegítjük fel 50 perc alatt, majd további 80 perc alatt 121 °C-ra melegítjük, végül lehűtjük. A lombikokban lévő táptalajokat beoltjuk a Bacillus licheniformis törzzsel, majd forgó rázógépen 240 fordulat/perc fordulatszámmal 5 napig rázatjuk 30°C-on . Ezután Anson-módszerrel meghatározzuk a proteázaktivitást. Az alábbi táblázatban feltüntetett eredményeket kapjuk, AU/kg egységben : 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
