182981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz koncentrátum előállítására mosóporhoz
1 182 981 2 A találmány tárgya eljárás a Bacillus licheniformistól származó proteáz koncentrátum előállítására. A találmány szerinti proteáz koncentrátumot tartalmazó készítmény csökkentett allergén hatású, és felhasználható például mosószerekhez, így háztartási mosóporokhoz. A mosószerekhez alkalmazott proteáz készítményeket általában meghatározott Bacillus licheniformis törzsek kultúrájából nyerjük ki. A mikroorganizmus a sejteken kívüli térben termeli a proteázt, amelynek koncentrátumát azután a permedéből különítjük el, például sókkal és/vagy oldószerrel történő kicsapással. A feldolgozást úgy végezhetjük, hogy a táptalajban proteáz-aktivitás gyakorlatilag nem marad vissza. A proteáz kinyerése azonban nem eléggé specifikus a proteázra, és ennek következtében a koncentrátum az enzimen kívül általában a táptalaj más alkotórészeit is tartalmazza. A mosószerek készítéséhez felhasználható kereskedelmi proteáz készítmények — például az Alcalase<R\ amelyet a dán Novo Iridustri A/S gyárt — előállítására a proteáz koncentrátumot olyan közömbös töltőanyaggal és segédanyagokkal keverik össze, amelyek segítségével meghatározott proteolitikus aktivitású, kevéssé porzó proteáz készítményt kapunk. A Bacillus licheniformistól származó kereskedelmi készítmények, például az Alcalase(R) legfőbb proteolitikus komponense a szubtílopeptidáz A (EC 3.4.21.14), amelyet a következőkben szubtilizinnek fogunk nevezni. Ez az enzim, amely tisztított és kristályosított alakban nyerhető ki a kereskedelmi termékből, az úgynevezett szerin-proteázok csoportjába tartozik, ahová a tripszin és a kimotripszin is. Az enzim nomenklatúra arra utal, hogy eredetileg az Alcalase(R> mikrobiális forrásának a Bacillus subtilist tekintették. Most már azonban általánosan elfogadott az, hogy az Alcalase(R)-t termelő mikroorganizmus a Bacillus licheniformis. Gyakorlatilag valamennyi fehérje — beleértve az ipari enzimeket is — különböző mértékben allergén, attól függően, hogy müyen fehérjéről van szó. A Bacillus licheniformis eredetű proteáz készítményeknél jelentős mértékű allergén hatást tapasztaltak már röviddel a kereskedelmi forgalomban való megjelenésük után, és azóta ezt az allergén hatást a proteáz készítmények használatával járó elkerülhetetlen kellemetlenségnek tekintik. Az enzimmel dolgozók és a felhasználók körében tapasztalható allergiás reakciók előfordulásának csökkentésére irányuló erőfeszítések mindeddig egyedül arra irányultak, hogy kevésbé porzó részecskéket használjanak. Például granulált vagy kapszulázott proteáz készítményekkel próbálták meg csökkenteni azt a kockázatot, amelyet a proteázzal való érintkezés az iparban dolgozó munkások és a háztartási mosóporok felhasználói számára jelent. Az erőfeszítések bizonyos mértékű eredménnyel jártak, amint azt az enzimtartalmú mosóporok egyre növekvő háztartási alkalmazása bizonyítja. Köztudott azonban, hogy az allergiás reakciók kifejlődése eléggé váratlanul is bekövetkezhet, ezért továbbra is szükség van olyan kereskedelmi proteáz készítményekre, amely lényegesen kevésbé allergén hatású, mint az ismert készítmények. A találmány célja Bacillus licheniformistól származó, csökkentett allergén hatású proteáz koncentrátumot tartalmazó készítmény biztosítása. A találmány további célja iparilag gazdaságos eljárás biztosítása csökkentett allergén hatású proteáz koncentrátum előállítására. A fentebb kitűzött célokat a kereskedelmi proteáz készítmények alkotórészeivel és ezek tulajdonságaival kapcsolatos megfigyeléseink alapján érjük el. A kvalitatív (de igen érzékeny) immunelektroforézis segítségével végzett és újabban publikált, például Grabar- Williams' szerinti vizsgálatok [R. Verbruggen és munkatársai, Biochim. Biophys. Acta, 365, 108—114/1974] azt mutatták, hogy a kereskedelmi forgalomban lévő proteáz készítmények — nevezetesen az AlcalaseW _ antigén szempontból heterogének. A Verbruggen által publikált [-Biochem. Journal, 151, 149 -155/1975] későbbi vizsgálatoknál kvantitatív agaróz gél immunelektioforézist végeztek, és azt tapasztalták, hogy az AlcalaseW fő proteáz komponensét — amely szubtilizin izoenzimekből áll — egy olyan protein komponens kisebb mennyisége kíséri, amely antigén szempontból eltér a fő proteáz komponenstől. A kereskedelmi proteáz készítmények összetételének további feltárására szolgáló egyik módszer — amely laboratóriumi méretben a készítmények frakcionálására is alkalmas — abból áll, hogy a táptalajból kinyert proteázkoncentrátumot ioncserélő kromatográfiának vetjük alá. Például 30 g mennyiségű, Bacillus licheniformistól származó proteáz koncentrátumot 5X35 cm méretű, 500 g karboxi-metil-cellulózt tartalmazó oszlopon kromatografáltunk. Az oszlopot 4 °C-on tartottuk és egyensúlyba hoztuk 0,005 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-maleátot és 0,002 M kalciumacetátot tartalmazó, 6,5 pH- értékű puffer-oldattal. Az eluciót ugyanezzel a pufferoldattal végeztük, és lineáris nátriumklorid-koncentrációgrádienst hoztunk létre az első maximum megjelenése után. A 210 ml/óra áramlási sebesség alkalmazásával vett frakciók (20 ml) optikai sűrűségét 280 nm hullámhosszúságnál ellenőriztük. Akromatogram az 1. ábrán látható. A kromatogram B maximumának megfelelő frakciókból kinyert fő proteáz komponens szubtilizin volt. (Az A maximum volt az első maximum). Nézetünk szerint a C maximummal jellemzett kisebb mennyiségű proteáz komponens azonos azzal a kisebb mennyiségű fehérje komponenssel, amelyet a fentebb ismertetett immunelektroforézis mutatott ki, és amely a leírások szerint antigén szempontból eltérő a fő komponenstől. Másképpen viszont nem jellemezték. A következők során ezt a kisebb mennyiségben jelenlevő proteáz komponenst „C komponens” néven fogjuk említeni. Azt tapasztaltuk, hogy a C komponens mintegy 5—15%-át képezi az AlcalaseW teljes proteáz-tartalmának. A további jellemzéshez a B, illetve C maximumnak megfelelő frakciókból nyert szubtilizin komponenst, illetve C komponenst agaróz gél elektroforézisnek vetettük alá. Az elektroforézist 0,07 5 M nátriumbarbitál puffer-oldatban végeztük, 8,0 pH-értéken, 10°C-on 60 percig, 15 V/cm feszültséggrádiens alkalmazásával. A mintákat 1 vegyes %-os oldatok alakjában vittük be. A 2. ábrán bemutatott elektroferogrammok azt mutatják, hogy a vizsgálati körülmények között határozottan eltérő a szubtilizin (I. helyzet) és a C komponens (II. helyzet) katódos vándorlási sebessége. Továbbá, az elektroferogrammokról az is leolvasható, hogy — mivel mindkét proteáz vándorlását sávok jellemzik, s mindegyiknél a fő sávot lassabban vándorló oldalsavuk kísérik — mind a szubtilizin komponens, mind pedig a C komponens többszörösen izoenzim rendszer [Verbruggen idézett közelménye]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
