182973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibakteriális hatású tienamicin antibiotikumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 182 973 2 A találmány tárgya eljárás egy új, antibakteriális hatású tienamicint vagy N-(l-2 szénatomos)-alkanoil-imidoil-tienamicint valamely dipeptidázinhjbitor kíséretében tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására. Ismeretes a szakirodalomból, hogy a kondenzált gyűrűs béta-laktám típusú antibiotikumok újabb csoportját képező tjenamicin-típusú antibiotikumok, mint maga a tienamicin és ennek félszintetikus származékai, elsősorban az N-formimidoil-tienamicin erős baktériumellenes hatással rendelkeznek, alkalmazhatóságukat azonban hátrányosan befolyásolja az a körülmény, hogy ezek az antibiotikumok érzékenyek az emlősállatok anyagcseréjének lebontó hatásával szemben. Ismeretes az is, hogy elsősorban az emlősállatok veséjében érvényesül az anyagcserének ez a tienamicin-típusú antibiotikumokat lebontó hatása és el is különítettek vese-kivonatokból egy olyan enzimet, amely katalizálja a tienamicin-antibiotikumoknak a béta-laktámgyűrű hidrolízise útján történő inaktiválását. A citológiai lokalizáció, a szubsztrátum-specifikusság és az enzim-inhibitorokkal szembeni érzékenység alapján történő vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy ez az enzim nagyon hasonló az irodalomban „dehidropeptidáz—I” néven is említett renális dipeptidáz (E.C.3.4.13.11) enzimhez, vagy talán azonos is azzal. Érdekes megjegyezni, hogy ennek az enzimnek a béta-laktamáz aktivitása kizárólag a tienamicin-típusú antibiotikumokkal szemben érvényesül; nem ismeretes más példa arra, hogy az emlősök anyagcseréje béta-laktám-hasítás útján inaktiválná a klasszikus béta-laktám típusú antibiotikumok, mint a penicillinek vagy a cefalosporinok bármelyikét is. Az ismert tienamicin-típusú antibiotikumok szerkezetileg az (I) általános képlettel jellemezhetők, ahol a jelen találmány szerinti eljárásban elsősorban tekintetbe jövő tienamicin, formimidoil-, illetőleg acetimidoil-tienamicin esetében X —CH2 —csoportot, Ra -S—CH2 —CH2 —NHZ általános képletű csoportot és ebben Z hidrogénatomot 1—2 szénatomos acil-imidoil- (tehát formimidoil- vagy acetimidoil-) csoportot, Rb pedig -CH(OH)-CH3 csoportot képvisel. .Az (I) általános képlet fenti meghatározásának megfelelő, Ra helyén —S—CH2 —CH2 —NH2 csoportot tartalmazó tienamicint Streptomyces cattleya fermentációja útján állították elő (3 950 357. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, megjelent 1976. 04. 13.); a tienamicinből kémiai úton előállítható N-imidoil-származékokat, mint az N-formimidoil-tienamicint és a vele analóg N-acetimidoil-tienamicint az 1977. 05. 16-án közzétett 848 545. sz. belga szabadalmi leírás ismerteti. Ezeken kívül számos további, részint közvetlen fermentáció útján, részint kémiai átalakítással előállítható, az (I) általános kép'etnek megfelelő, de Ra, R'1 és X helyén más szubsztituenseket, illetőleg csoportokat tartalmazó tienamicin-típusú antibiotikumot is előállítottak és ismertettek az irodalomban. A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen alkalmazható kristályos N-formimidoil-tienamicin egy célszerű előállítási módját az alábbiakban részletesen ismertetjük. Analóg módon állítható elő a már ugyancsak ismert és a találmány szerinti eljárásban szintén jó eredménnyel alkalmazható N-acetimidoil-tienamicin is. Kristályos N-formimidoil-tienamicin előállítása A, lépés: Benzilformimidát-hidroklorid előállítása Adagoló tölcsérrel, keverővei és visszafolyató hűtővel ellátott 3 literes háromnyakú lombikba az alábbi elegyet töltjük: 125 g (1,15 mól) benzil-alkohol, 51 g (1,12 mól) formamid és 1200 ml vízmentes éter. Az elegyet szobahőmérsékleten (20—25 °C) élénken keverjük nitrogénat noszféra alatt, miközben cseppenként 50 ml vízmentes éterben oldott 157 g (1,12 mól) benzoil-kloridot adunk hozzá az adagoló tölcsér segítségével. A hozzáadás körülbelül 50 percet vesz igénybe. A reakcióelegyet további 60 percig keveijük szobahőmérsékleten. Az étert dekantálással eltávolítjuk, és 500 ml vízmentes éterben oldott 300 ml ecetsav-anhidridet adunk hor^á. Az elegyet 30 percig keverjük szobahőmérsékleten. A keletkezett csapadékot leülepedni hagyjuk és az étert, valamint az ecetsavanhidridet tartalmazó fázist dekantálással eltávolítjuk. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, 500 ml éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk KOH felett 25 °C-on, két óráig. 130 g (677') benzilformimidát-hidrokloridot kapunk fehér, szilárd anyag formájában. A termék elemzése NMR spektrometriával történt: 5 (DMSO), 5,7 (s, 2H, ncHj), 7,5 (s, 5H, <p). 9.0 (s. 1H. HC=N). A termék formimidra és benzil-kloridra bomlik 0 C feletti hőmérsékleten. —20 °C-on történő tárolásnál azonban 2 hónap múlva sem volt számottevő bomlás megfigyelhető. Bjlcpcs: Tienamiein-származék előállítása 6 liter vizes tienamicin-oldatot helyezünk egy 12 literes lombikba, és 0 'C-ra hűtjük (a tienamicin-oldat pli-ja 6,5 és fermentlé betöményítésével állítottuk elő. és 28 g tienamicint tartalmazott). A lombikot pH-rnéterrel és nagy sebességű jó hatásfokú keverővei látjuk el. Az oldat pH-jdt 3n KOH óvatos hozzáadásával 8.5-re emeljük. (A KOH-ot cseppenként fecskendő segítségével adagoljuk a/ oldathoz keverés közben.) Az oldatot 6 ekvivalensnyi körülbelül 100 g szilárd benzil-formimidát-hidrokloriddal kezeljük részletekben, miközben a pH-értékét 8.5 ±0.3-nál tartjuk 3n KOH (200 ml) adagolásával fecskendő segítségével. Az adagolás 3-5 percet vesz igénybe. A reakcióelegyet 6 percig keverjük 0°C-on, majd folyadék-kromatográfiával ellenőrizzük, hogy a reakció teljesen végbement-e. Az oldat pH-ját I n îICI segítségével 7-re állítjuk be. A reakcióelegy térfogatát lemérjük és az oldatot UV-fénnyel megvizsgáljuk. A semlegesített reakcioelegyet 15 g/literre betóményítjük fordított ozmózis berendezés segítségével 10 °C alatti hőmérsékleten. A koncentrátum térfogatát ismét lemérjük és pH-ját 7.2 7.4-re állítjuk be, ha ettől eltérő volna. A koncentrátumból ezután közepes porozitású szinter-üvegszűrőn leszűrve eltávolítjuk a betöményítés után visszamaradt szilárd részeket. Cj'öpcs: Kronratográfia Dowex 50WX2 oszlopon A betöményített oldatot (750—1000 mi. 15-20g) 0'C-ra hűtve egy előhűtött, 18 literes kálium-cikiusban lé\ő Dowex 50 \VX2-vel töltött oszlopra öntjük (200- 400 mesh méretű gyanta), és az oszlopot 0-5 C-on desztillált ioncserélt vízzel eluáljuk, 90 ml/perc sebességgel és 0—310 KPa túlnyomáson 4 liter, 2 liter, majd 1 liter előfrakciót. majd ezután 18-szor450 ml-es frakciót, és végül 2 liter utófrakciót gyűjtünk össze. A frakciókat UV-fénnyel ellenőrizzük (1/100-as hígításban, NH2 OH 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
