182650. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új cefém- és cefém-származékok előállítására
182 650 K) módszer [(K) reakcióvázlat]: karboxil-csoport kialakítása Ezzel az eljárással (Ik) általános képletű szabad karboxil-vegyületeket vagy azok sóit állítjuk elő. Különösen előnyösen állíthatunk elő olyan (Ik) általános képletű vegyületeket, amelyekben R1 tiadiazolilcsoportot vagy (I) általános képletű tiazolil-csoportot jelent (ahol R6 jelentése a fenti), míg A (2) általános képletű csoportot képvisel (ahol R2 jelentése a fenti). Ezek a szabad karboxil-vegyületek a megfelelő, (XIII) általános képletű karboxil-származékoknál rendszerint nagyobb mikrobaellenes hatással rendelkeznek. Az eljárás során a (XIII) általános képletű karboxilszármazékokban szabad karboxil-csoportokat alakítunk ki. Kiindulási anyagokként igen előnyösen használhatunk fel olyan (XIII) általános képletű vegyületeket, amelyekben R^ észterezett karboxil-csoportot jelent: A szabad karboxil-csoportot szokásos módszerekkel, például hidrolízissel, redukcióval vagy hasonló módon alakíthatjuk ki. A szabad karboxil-csoport hidrolitikus kialakítása során hidrolizálószerként például savat, bázist, enzimet vagy enzimkészítményt használhatunk fel. Savas vagy lúgos hidrolizálószerekként például az E. módszernél felsorolt anyagokat használhatjuk fel. A savas vagy lúgos hidrolízist az E. módszernél ismertetett körülmények között hajthatjuk végre. A hidrolitikus műveletekhez enzimként észterázokat és megfelelő észteráz-hatással rendelkező észteráz-készítményeket használhatunk fel. Az észterázokat nyers és tisztított állapotban egyaránt alkalmazhatjuk. Észteráz-forrásként például mikroorganizmusok tenyésztésével kapott fermentleveket, feldolgozott mikrobiológiai anyagokat, állati vagy növényi szövetpreparátumokat (előnyösen fermentleveket vagy feldolgozott mikrobiológiai anyagokat) használhatunk fel. Ismeretes, hogy számos mikroorganizmus rendelkezik észteráz-aktivitással. Ezek a mikroorganizmusok például ismert módszerekkel különíthetők el talajmintákból vagy egyéb forrásokból, vagy közismert mikroorganizmus-törzsgyűjteményekben állnak a köz rendelkezésére. A mikroorganizmus-törzsgyűjtemények közül példaként a következőket soroljuk fel: ATCC (American Type Culture Collection, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), IÁM (Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Japán), IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japán), IID (The Institute for Infectious Diseases, University of Tokyo, Japán), CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Bearn, Hollandia), FERM (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japán) és NRRL (Northern Utilization Research and Development Division, U.S. Department of Agriculture, Illinois, Amerikai Egyesült Államok). Az észteráz-akti vitással rendelkező mikroorganizmusok közül példaként a Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Salmonella, Staphylo-19 coccus, Vibrio, Microbacterium, Escherichia, Arthrobacter, Azotobacter, Alcaligenes, Rhizobium, Brevibacterium, Kluyvera, Proteus, Sarcina, Pseudomonas, Xanthomonas, Protaminobacter és Comamonus nemzetségbe tartozó törzseket említjük meg. E mikroorganizmus-törzsek közül példaként a következőket soroljuk fel: Bacillus subtilis IÁM—1069, IÁM—1107 és IÁM—1214, Bacillus sphaericus IÁM—1286, Corynebacterium equi IÁM—1308, Micrococcus variáns IÁM—1314, Flavobacterium rigeus IÁM—1238, Salmonella typhimurium IÁM—1406, Staphylococcus epidermis IÁM—1296, Microbacterium flavum IÁM— 1642, Alcaligenes faecalis ATCC—8750, Arthrobacter simplex ATCC—6946, Azotobacter vinelandii IÁM— 1078, Escherichia coli IÁM—1101, Rhizobium japonicum IÁM—0001, Vibrio metchnikovii IÁM—1039, Brevibacterium helvolum IÁM—1637, Protaminobacter alboflavum IÁM—1040, Comamonas terrigena IFO-12685, Sarcina lutea IÁM—1099, Pseudomonas schuylkilliensis IÁM—1055 és Xanthomonas trifolii ATCC—12287. Az enzimes hidrolízishez az észterázt előnyösen észteráz-aktivitással rendelkező mikroorganizmusok tenyésztésével kapott fermentlé vagy feldolgozott fermentlé formájában használjuk fel. A mikroorganizmusokat hagyományos módon tenyészthetjük. Tenyésztési közegekként asszimilálható szén- és nitrogénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó táptalajokat használhatunk fel. Szénforrásként előnyösen például glükózt, szacharózt, laktózt, cukrokat, glicerint és keményítőt, nitrogénforrásként pedig előnyösen húskivonatot, peptont, gluténlisztet, kukoricalisztet, gyapotmaglisztet, szójalisztet, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, kazein-hidrolizátumpt vagy aminosavakat, továbbá szervetlen vagy szerves nitrogénforrásokat, így ammóniumsókat (például ammóniumszulfátot, ammóniumnitrátot vagy ammóniumfoszfátot) vagy nátriumnitrátot használhatunk fel. Kívánt esetben a táptalajhoz ásványi sókat, így kalciumkarbonátot, nátrium- vagy káliumfoszfátot, magnéziumsókat vagy rézsókat, továbbá különféle vitaminokat is adhatunk. A tenyésztés pH-ja, hőmérséklete és ideje az alkalmazott mikroorganizmus típusától függően változik. A tenyésztést rendszerint 5 és 8 közötti pH-értékű közegben, általában körülbelül 20 °C és 35 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A tenyésztési idő rendszerint 20—120 óra lehet. A kapott fermentlevet közvetlenül vagy feldolgozott állapotban egyaránt felhasználhatjuk az enzimes hidrolízishez. A „feldolgozott fermentlé” megjelölésen minden olyan észteráz-aktivitással rendelkező készítményt értünk, amelyet a fermentlé hagyományos feldolgozási műveleteivel (például az aktív anyag feldúsításával) állítunk elő. A fermentlében levő észteráz-aktivitású anyag sejthez kötött (intracelluláris) és/vagy sejten kívüli (extracelluláris) állapotban fordulhat elő. Ha az észteráz-aktivitású anyag elsősorban sejthez kötött állapotban van jelen, az enzimes hidrolízishez 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
