182462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására
182 462 4 A találmány tárgya eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására. A találmány különösen egy és/vagy kettősláncú nukleiinsavakbál, főleg dezoxiribonu’kleinsavakból (a továbbiakban DNA-ként rövidítve) álló keverékek affinitáskromotográfiás elválasztására vonatkozik. Az egyes gének vagy azonos gének ismétlődő elrendezésű készleteinek elkülönítése eukariotikus sejtek genomjából nem csupán tisztán tudományos szempontból érdekes, hanem géntechnológiai szempontból gyakorlatilag is nagy jelentőségű. Az ilyen elkülönítésre eddig azonban csak akkor volt lehetőség, ha a gén vagy a géncsoport és térbeli távolságot létesítő csoportjainak (,,spacer”-jeinek) bázisösszetétele legalább 6—7%-kal eltért az összgenom közepes bázisösszetételétől. Szétválasztó eljárásként többnyire a DNA-bázisspecifikus adalékokkal, így például ezüst-, higany- vagy platinaionokkal vagy aktinomicinnel, netropszinnal vagy a „Hoechst 33 258” jelzésű színezékkel végrehajtott céziumion sűrűséggradienscentrifugálásokat alkalmazták. Ezek az eljárások azonban csak korlátozott kapacitásúak, költségesek és időtrablók. A biopolimerek affinitáskromatográfiájára alkalmas anyagok kifejlesztése az elmúlt években erősen leegyszerűsítette egy sor biopolimer elkülönítését vagy egyáltalán lehetővé tette tiszta állapotban történő előállításukat. Ennél az eljárásnál rendszerint olyan hordozóanyagból indulunk ki, amelyet valamilyen anyaggal végrehajtott kémiai aktivitás útján úgy alakítottak át, hogy az az elkülönítendő biopolimert a lehető legnagyobb mértékben specifikusan kösse meg. E specifikusság alapján a keresett biopolimer anyag ideális esetben hasonló vegyületek keverékéből szelektíven adszorbeálható a kromatografáló anyagra, majd ezt követően arról, alkalmas körülmények között, tiszta állapotban deszorbeálható [P. Cuatrecasas és C. B. Anfinsen, Ann. Rev. Biochem. 40 (1971) 259—278], Az e módszer sikeres alkalmazását igazoló példák sokasága ellenére sem sikerült azonban számos biopolimert illetően mind a mai napig olyan kromatográfiás anyagot kifejleszteni, amellyel nukléinsav elegyek is hasonlóan, szelektíven és programozhatóan szétbonthatók. A nukléinsav elegyek gramnyi mértékben való nagy felbontóképességű frakdonálása viszont előfeltétele az egyes gének vagy azonos gének készletei megfelelő elkülönítésének. A kismolekulasúlyú nukleinsavak — például a transzfer-ribpnukleinsavak — szétválasztására alkalmas jelenlegi eljárások esetében a különböző fajtákra történő szétválasztást olyan adszorbenseken érik el, amelyek az ioncserélő tulajdonságokat a lipofil kölcsönhatással kombinálják (R. M. Kothari és V. Shankar, Journal of Chomatography 98. 119741, 449-475. lapok). Itt lényegében a hordozó és a nukleinsavak ritka bázisai közötti kölcsönhatás lehetőségeit használják ki, amely ritka bázisok a különféle transz' 3 fer-ribonukleinsavakban eltérő mennyiségben vannak jelen. Minthogy azonban a nagyobb molekulasúlyú ribonukleinsavak és dezoxiribonukleinsavak rendszerint nem tartalmaznak ritka bázisokat, a szétválasztásukra irányuló módszerek csak a következő különbözeti ismérvek alapján építhetők fel: a) az egyes és kettős láncok aránya b) a bázisösszetétel eltérései c) a bázisszekvencia eltérései d) molekulasúlykülönbségek e) a tercier struktúra eltérései. Mindezen ismérveket ténylegesen is használják a napjainkban szokásosan alkalmazott frakcionáló módszereknél [R. M. Kothari, Chromatog. Rév. 12 (1970) 127—155. lapok], A leghatékonyabb módszernél, az ultracentrifugás, sógrádienses frakcionálásnál a b), c) és e) szerinti különbözőségek az egyes DNA-fajták lebegősűrűségeinek olyan eltéréseihez vezetnek, amelyek bázisspecifikus anyagok hozzáadásával niég fokozhatok is. Az elválasztás élessége a molekulasúly csökkenésével, a kapacitás a molekulasúly növekedésével csökken. Hidroxi-apatiton végrehajtott adszorpeiós kromatográfiánál a frakcionálás lényegében az a) és csak csekélyebb' mértékben a b) eltérés szerint megy végbe, míg a guanin-citozinban gazdagabb nukleinsavak már valamivel kisebb sókoncentrációknál deszorbeálódnak, mint az adenin-timinben dúsabb komponensek [W. Pakroppa és W. .Müller, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 71 (3) (1974) 699—703 lapok]. Ezzel teljesen analóg módon a kettősláncú nukleinsavak specifikus protein-szilikagél-adszorbenseken (például metilszérum-albumin-szilikagélen) a bázisösszetétel eltéréseinek megfelelően frakcionálható, aholis megint előbb a guanin-citozinban gazdagabb DNA-fajták eluálódnak [J. D. Mandell és A. D. Hershey, Analytical Biochemistry 1 (1960) 66—77. lapok, valamint N-Sueoka és Tsai-Ying Cheng, J. Mól. Bioi. 4 (1962) 161—172. lapok]. Ezen.inkább véletlen folytán felfedezett adszorbensek tulajdonképpeni hatásmódja ismeretlen. Ezért ezeknek az anyagoknak a csekély elválasztási élességét minden fáradozás ellenére sem sikerült máig sem alapvetően javítani. . , Csak a legutóbbi évek során sikerült számos, a nukleinsavakkal komplexeket alkotó anyagok módszeres vizsgálata során olyan vegyületeket találni, amelyek. az affinitáskromatográfia céljaira alkalmas anyagok célzott szintéziséhez alkalmasaknak tűntek [W. Müller és D. M. Crothers, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 267—277. lapok; W. Müller, H. Bünemann és N. Dáttagupta, Eur. J. Biochem. 54. (1975) 279—291. lapok, valamint W. Müller és F. Gautier, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 385—394. lapok]. Hogy az ilyen,alaposan megvizsgált anyagok alkalmazása a nükleinsavelegyek szétválasztásánál milyen előnyöket jelent, azt már a hidroxi-apatit és a bázisspedfikús adalékként használt etidium-bromid komplex alkalmazása a szuperhelikális és helikális DNA elválasztására [W. Pakroppa, W. Goebel és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
