182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
13 132458 14 amidino-fenilészter, p-metoxi-benzoesav-p’-ami-di-no-fenilészter és p-metoxi-benzoesav-p’-acetamidino-fenilészter említhetők. Mind a közvetlen, mind az inverz blokkolási reakciókat vizes közegben folytatjuk le, oly pH- tartományban, amelyben az enzim nem szenved károsodást és amely sem a blokkolószerre, sem a keletkező reakciótermékre nincs káros befolyással ; az alkalmas pH-tartomány 4 és 8 között, előnyösen 5,0 és 7,5 között lehet. A reakciót általában az enzim és a blokkolószer mól-ekvivalens mennyiségeinek alkalmazásával folytatjuk le, alkalmazhatjuk azonban a blokkolószert feleslegben is. Általában előnyös, ha a reakciót híg oldatban, az enzimre számítva legfeljebb 10“3 mólos és a blokkolószerre számítva legfeljebb 10”3 mólos oldatban folytatjuk le. Általában a reakció során alkalmazható enzim- illetőleg blokkolószerkoncentráció alsó határa 10”’ mól lehet. A blokkolási reakciót szobahőmérsékleten vagy ennél valamivel alacsonyabb hőmérsékleten folytatjuk le ; különösen előnyösen -f-10 °C és a reakcióközeg fagyáspontja közötti hőmérsékleten dolgozhatunk. A reakció lefolyására szükséges idő függ az alkalmazott blokkolószer természetétől, a reakcióhőmérséklettől és a kiindulási anyagként alkalmazott enzimtől. Az egyes adott esetekben optimális reakcióidőt oly módon állapíthatjuk meg, hogy a reakcióelegy aliquot-mintáit valamely kromogén vagy fluorogén szubsztrátummal inkubáltatjuk és követjük az enzim-aktivitás csökkenését. A reakció teljes befejeződése után a kapott származékot a szokásos módszerek, mint dialízis, affinitás-kromatográfia és/vagy ultraszűrés alkalmazásával tisztítjuk, majd ugyancsak a szokásos módszerekkel, például liofilizálással különítjük le a vizes közegből. Amennyiben szükséges, a terméket például sterilizálás útján tehetjük alkalmassá intravénás injekcióban történő beadás céljaira. Az EF általános képletű inverz blokkolószerek — ahol E p-amidino-fenoxi-csoportot és F acilcsoportot képvisel — oly módon állíthatók elő, hogy p-hidroxi-benzamidint vagy ennek valamely sóját egy FX általános képletű acilezőszerrel •—• ahol F jelentése megegyezik a fenti meghatározás szerintivel, X pedig hidroxilcsopoTtot vagy ennek valamely acilezésre képes aktivált származékát képviseli — reagáltatunk, kívánt esetben katalizátor jelenlétében. Az acilezésre képes aktivált származékok példáiként az acil-kloridok és -bromidok említhetők. Ezeket a származékokat a szokásos, önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Az eljárás során alkalmazható katalizátorok példáiként szerves tercier bázisok, mint piridin, továbbá a kondenzációt elősegítő szerek, mint diciklohexil-karbodiimid említhetők. Az acilezési reakciót általában valamely poláros szerves, a reakció szempontjából közömbös oldószerben folytathatjuk le. Az alkalmas oldószerek példáiként a N,N-dimetil-formamid és a dimetilszulfoxid említhetők. Ha katalizátorként valamely folyékony anyagot, például piridint alkalmazunk, akkor a reakciót külön oldószer alkalmazása nélkül is lefolytathatjuk. A reakciót általában mérsékelten felemelt hőmérsékleten, célszerűen 70 °C alatti, különösen 40 °C alatti hőmérsékleten folytatjuk le; legelőnyösebben szobahőmérsékleten dolgozhatunk. A reakció teljes lefolyásához szükséges idő függ az alkalmazott reagensek természetétől, az oldószertől és a reakcióhőmérséklettől. A reakció teljes végbemeneteléhez szükséges időt a reakeióelegy kivett mintáinak vékonyréteg-kromatográfiai vizsgálata útján határozhatjuk meg. A reakció teljes lefolyása után a reakcióterméket a szokásos módszerekkel tisztíthatjuk és nyerhetjük ki a reakeióelegy bői. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható oly inverz blokkolószerek, amelyek fenti általános képletében E szubsztituált benzoilcsoportot képvisel, új, az irodalomban eddig le nem írt vegyilletek. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre nem korlátozódik e konkrét példák tartalmára. Az alábbi 1—7. példa az inverz blokkolószerek előállítási módját szemléltetik. 1. példa Benzoesav-p-am idino-f enilészter-h idroklcrid. 0,172 g p-hidroxi-benzamidin-hidrcklcridot 1,0 ml vízmentes piridinben oldunk és az oldathoz cseppenként hozzáadjuk 0,141 g benzoil-klorid 1.0 ml piridinnel készített oldatát. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük, majd ugyancsak szobahőmérsékleten 4 óra hosszat állni hagyjuk. A reakcióelegyet ezután csaknem szárazra pároljuk, majd a maradékot vízmentes dietil-éterrel eldörzsöljük és az így kapott szilárd terméket propan-2-ol és dietil-éter 2 : 1 térfogatarányú elegyéből (körülbelül 3 ml oldószerelegyet alkalmazva) átkristályosítjuk. Ily módon 0,223 g benzoesav-p-amidino-fenilészter-hidrokloridot kapunk, amely 160 °C-on olvad. XMR (d'-dimetil-szulfoxidban) : 9,65 (dublett, 4H, D20-dal kicserélhető ; amidin H) ; 8.0 (multiplett, 9H, fenil- és amidino-fenil-csoport). A fent leírthoz hasonlóan állítjuk elő a megfelelő kiindulási vegyületekből az alábbi 2.—10. példában leírt vegyületeket is. 2. példa. t ransz-Fabéjsa v-p-amidino-f enilészt er-hidroklorid op. : 193 °C. XMR (d6-dimetil-szulfoxidban) : 9,55 (dublett, 4H, kicserélhető deuterium-oxiddal; amidin-H); 7.95 (multiplett, 6H, arnidino-fenil- és akriloil-H); 7,10 (multiplett, 5H, fenil-H); 6.96 (dublett, J : 16 Hz, 1H, akriloil-H). 3. példa p-Metoxi-benzcesav-p’-amidino-fenilészter-hidroklorid Propan-2-olból átkristályosítva op. : 225 °C. NMR (d“-dimetil-szulfoxidban) : 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
