182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
9 182458 10 és mérjük a szubsztrátum konverziójának a sebességét. A hidrolízist addig követjük, míg a szubsztrátum konverziójának a sebessége maximális értéket nem ér el. Ekkor a k sebességi állandót oly módon számítjuk ki, hogy a log, (1—A t/Amix) értéket a t idővel állítjuk szembe; a fenti képletben AmllI a kivett aliquot-minta általi szubsztrátum-konvenzió maximális sebessége, A, pedig az a sebesség, amellyel az aliquot minta a t időpontban konvertálja a szubsztrátumot. Az enzim katalitikus helyeinek blokkolására alkalmazott védőcsoport megválasztása függ attól is, hogy milyen enzimet alkalmazunk, és hogy az előállítandó származékot milyen célra kívánjuk felhasználni. így például plazmin és sztreptokináz/plazminogén aktivátor-komplex esetében a proteolitikus aktivitás szempontjából lényeges katalitikus enzimhelyek szabad hidroxilcsoportú szerin-csoportot tartalmaznak. Ezeket a katalitikus helyeket célszerűen acil-csoportokkal, mint benzoil-, helyettesített benzoil-, akriloil- vagy helyettesített akriloilcsoportokkal blokkoljuk. Valamely adott helyettesített-benzoil-származék esetében az ezzel blokkolt enzim-származék pszeudo-elsőrendű hidrolízis sebességi állandóját a szubsztituens Hammett-féle v-érték alapján állapíthatjuk meg, ha megmértük két vagy több helyettesített benzoil-származék pszeudo-elsőrendű hidrolízis-sebességi állandóját, feltéve, hogy az illető szubsztituens és az enzim között nem lép fel valamilyen különleges kölcsönhatás. Általában ismeretes, hogy a méta- és paraszubsztituensek esetében a Hammett-értékek (<rm és ctp) elfogadható becsült értékeket adnak a hidrolízissebességre vonatkozólag. Emellett a om és aB értékek elfogadható pontossággal összegezhetők valamely más, egynél több szubsztituenst tartalmazó szubsztituált benzoilcsoport kinetikai tulajdonságainak a kiszámítására. Az orto-szubsztituensek Hammettértékei (cr0) nem összegezhetők ugyanolyan megbízhatóan, mint a <rm és ap értékek, minthogy sztérikus hatások befolyásolják ezeket. Ha azonban az orto-szubsztituens kis térkitöltésű és ezért elhanyagolható sztérikus hatást fejt csupán ki, mint például a fluor-atomok, metil- és metoxiesoportok esetében, akkor az ilyen szubsztituensek c0 értékei az általában elfogadott hibahatárokon belül alkalmazhatók önmagukban vagy a <rm és/vagy értékekkel összegezve, a reakciósebességek kiszámítására. A fenti korlátozások keretein belül az oly helyettesített benzoilcsoportok, amelyekben a fenilgyűrű egy vagy több helyettesítőt, különösen méta- és/ vagy para-helyettesítőt hordoz, amelyeknél a Hammett-féle a-értékek összege 0,1 és 1,1 között van, jól alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban a humán plazmin blokkolására. Az olyan szubsztituált benzoilcsoportok, amelyekben a fenilgyűrű egy vagy több szubsztituenst hordoz, különösen méta- és/vagy para-szubsztituenst, amelyeknél a Hammett a-értékek összege —0,9 és +0,3 között van, a sertés-plazmin katalitikus helyeinek blokkolására alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. A fenti célra alkalmas benzoil- és helyettesített benzoilcsoportok példáiként a következők említhetők: benzoil-, adott esetben halogénatomokkal, 1—6 szénatomos akrilcsoportokkal, 1—6 szénatomos alkoxicsoportokkal, 1—6 szénatomos alkanoiloxi-csoportokkal vagy 1—6 szénatomos alkanoil-amino- (RCONH-) csoportokkal helyett esítet t benzoilcsoportok, mint például benzoil-; p-fluorbenzoil-, o-, m- vagy p-toluil-, o- ,m- vagy pmetoxi-benzoil- (vagyis anizoil-), o-, m- vagy petoxi-benzoil-, 2,4-dimetoxi-benzoil-, 3,4-dimetilbenzoil, 4-butil-benzoil-, 3-metil-4-metoxi-benzoil-, o-acetoxi-benzoil- (vagyis acetil-szaliciloil-) és pacetamido-benzoil-csoportok. Ugyancsak alkalmazható további aromás csoportként a naftoilcsoport is. A fenti általános szabály alóli kivételnek tekintendők az olyan benzoilcsoportok, amelyek valamilyen bázisos szubsztituenst, mint amino-, dimetil-amino- vagy guanidinocsoportot tartalmaznak. Az ilyen származékok hidrolízis-sebessége a számított értéknél tízszer kisebb is lehet. Az ilyen csoportok, mint a p-guanidino-benzoilcsoport humán plazmin és sertés-plazmin blokkolására is alkalmazhatók. A humán és sertés-plazminnak a találmány szerinti eljárásban való blokkolására alkalmas acilcsoportok további példáiként az akriloil- és helyettesített akriloilcsoportok, különösen a cinnamoil- és helyettesített cinnamoilcsoportok említendők, amelyek egy vagy több szubsztituenst tartalmaznak, különösen a méta- és/vagy para-helyzetben és amelyeknél a Hammett-féle c-értékek összege —1,0 és +0,15 között van (a fent említett korlátozások figyelembevételével). A találmány szerinti eljárásban alkalmazható helyettesített akrilolilcsoportok példáiként az 1—6 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó alkil-akriloil-, furil-akriloil-, cinnamoil- és 1—6 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó alkil-cinnamoil-csoportok, mint 3,3-dimetil-akriloil-, 2-furil-3-akriloil-, cinnamoil- és p-metil-cinnamoil-csoport említhetők. A találmány szerinti eljárással előállítható gyógyszerkészítményeket a szokásos gyógyszerészeti eljárásokkal állíthatjuk elő, a humán terápiában intravénásán beadható gyógyszerkészítmények ismert előállítási eljárásai szerint. Intravénás alkalmazásra felhasználható gyógyszerkészítmények jellemző példáiként a steril származékok steril izotóniás vizes pufferoldatokkal készített oldatait említhetjük. Amennyiben ez szükséges, a készítmény tartalmazhat valamely szolubilizáló szert is, az enzim-származék oldatban tartásának elősegítésére ; tartalmazhat továbbá valamilyen helyi érzéstelenítőszert, mint lidokaint, az injekció helyén fellépő fájdalom csökkentésére. Az enzimszármazékokat általában adagolási egységeikben szereljük ki, például száraz por vagy vízmentes koncentrátum alakjában, légmentesen lezárt tartályban, például ampullában vagy tasakban. Az ilyen adagolási egységekben a burkolaton feltüntetendő az enzim mennyisége (aktivitás-egységekben), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
