182322. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-nitro- 9-(hidroxi-alkil-amino)-akridinek és sóinak előállítására
3 182322 4 és ezzel a vegyületek alkalmazási területét erősen korlátozzák. A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű vegyületek — ebben a képletben R egyenes vagy elágazó szénláncú, 2—4 szénatomos alkiléncsoportot jelent — és sóiknak az előállítására. A találmány szerint az (1) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy l-nitro-9-fenoxi-akridint fenolban oldunk, az oldathoz a megfelelő hidroxialkilamint vagy annak sóját adjuk közel ekvimoláris mennyiségben, a reakcióelegyet 60— 100 °C-ra melegítjük, majd a reakcióterméket elkülönítjük és kívánt esetben sóvá alakítjuk. A reakcióelegy feldolgozásakor előnyösen úgy járunk el, hogy az elegyet lehűtjük és nagyobb térfogatú apoláris oldószerbe öntjük. Alkalmas oldószerek például dietiléter és benzol. A kivált csapadékot kiszűrjük és valamilyen vízmentes poláris szerves oldószerből vagy az ilyenek elegyéből átkristályosítjuk. Poláris oldószerként például metanolt, etanolt vagy azok elegyét alkalmazhatjuk. A kiindulási anyagként szükséges aminkomponensként az alábbiakat soroljuk fel: 2-amino-butan-l-ol, annak hidrokloridja, 3-amino-propanol-hidroklorid, 4-amino-butan-1 -ol-hidroklorid. A sóképzéshez előnyösen sósavat használunk, de szerves savak, így citromsav, borkősav, tejsav és metánszulfonsav alkalmazása szintén lehetséges. A találmány szerint előállított vegyületek a technika állásából ismert vegyületektől a 9-es helyzetben kapcsolódó szubsztituensben különböznek, ugyanis az (I) általános képletű amino-akridinek nem tartalmaznak omega-nitrogénatomot, helyét a hidroxicsoport foglalja el. Az (I) általános képletű vegyületek in vivo és in vitro erős daganatgátló hatást mutatnak. Farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a vegyületek kevésbé toxíkusak, mint az ismert amino-akridin-származékok. Az (I) általános képletű vegyületek egyik képviselője már klinikai kipróbálás alatt van. Az (I) általános képletű l-nitro-9-hidroxialkil-amino-akridinek növekedésgátló és ezen belül tumornövekedés-gátló hatását az alábbi tesztekkel vizsgáltuk in vitro és in vivo. I. In vitro eljárások a) A habfű csírázásának gátlása (Lepidium Sativum) 80. mm átmérőjű Petri-csészét két réteg szűrőpapírral bélelünk ki, és a papírra lehetőleg egyenletesen 20—25 habfűmagot helyezünk. A szűrőpapírt a vizsgálandó vegyület 1 mg/ml koncentrációjú oldatának 30 ml-ével átitatjuk, kontroll csészékben desztillált vizet alkalmazunk. A csészéket 24 órán át 20—30 °C-on inkubáljuk, utána a csírák hosszát megmérjük. A gátló hatást százalékban fejezzük ki, amikor is a kontroll csírák hossza 100%. Az (I) általános képletű vegyületek a csírahosszat 87— 94%-kal csökkentették. b) Miyamura eljárás (Ehrlich-féle ráksejtekkel) Az eljárás lényege, hogy 5 x 106 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziókban megvizsgáljuk a vegyületeknek a ráksejtek dehidrogenáz-aktivitására kifejtett gátló hatását. A vizsgált vegyület 1%-os oldatát tartalmazó henger körül 37 °C-on végzett 5 órás inkubálás után köralakú zóna alakul ki, amelyben az alkalmazott redoxszínezék nem redukálódott. Redox-színezékként resasurint alkalmazunk. Általánosan elismert elv, hogy aktívnak minősül az olyan vegyület, amely körül legalább 20 mm átmérőjű gátolt zóna alakult ki. Az (I) általános képletű vegyületek ebben a tesztben 31—33 mm átmérőjű gátolt zónát eredményeztek. c) Szövetkultúra — ún. KB-vonal Ezt a vizsgálatot Eagle és Foley [Cancer Research 18, 1017—25, (1958)] módszerének Smith és munkatársai [Cancer Research 19, 843—846 (1959)] által módosított változata szerint végeztük. Embertől származó daganatsejteket, az ún. KB-vonalat alkalmaztuk, a sejteket 10% borjúsavót tartalmazó Eagle tápközegben tenyésztettük kémcsövekben. Mindegyik kémcsőbe egy milliliter sejt-szuszpenziót (40—80 000 sejt) adtunk, ami 40—80 u.g sejtfehérjének felel meg. A tenyészet növekedését a sejtfehérje mennyiségének meghatározása alapján mértük. A mérést fotometrikusan, Folin—Cicaltanreagens alkalmazásával Oyam et al. [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 91, 305—307 (1956)] módszere szerint végeztük. A kémcsövek beoltásával egyidejűleg a vizsgálandó vegyület vízzel készített oldatából 0,9-0,9 ml-t adtunk a kémcsövekbe. Az oldatok koncentrációját úgy választottuk meg, hogy a tápközegben a koncentráció 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, illetve 0,0001 [xg/ml volt. A kémcsöveket ezután 37 °C-on 72 órán át inkubáltuk. Ezt követően mind a kísérleti vegyületeket tartalmazó, mind a kontroll kémcsövekben meghatároztuk a sejtfehérje megnövekedett mennyiségét. Minden kísérletet kétszeres ismétléssel végeztünk. Azt a koncentrációt határoztuk meg, amely a sejtfehérje többletmennyiségét a kontrolihoz képest 50%-kal csökkentette (ID50-érték). A gátlás százalékos értékét az alábbi képlet alapján számítottuk ki : vmFk-kmFk ahol vmFk=a fehérje végmennyisége a kontroliban, vmFt = a fehérje végmennyisége a tesztben, kmFk=a fehérje kezdeti mennyisége a kontroliban. Általánosan elfogadott szabályok szerint [Leiter et al., Cancer Res. Supl., Cancer Chemotherapy Screening Data XXXV, 2, 25, 522—580 (1965)] aktívnak az a vegyület minősül, amelynek gátló koncentrációja (ID50) 1 p,g/ml-nél kisebb. A fenti szerzők úgy vélik, hogy az ilyen vegyületeket — az in vivo kísérletek eredményétől függetlenül — klinikailag ki kell próbálni. Az (I) általános képletű vegyületekkel a fenti tesztet többször ismételtük. Az l-nitro-9-(hidroxietil-amino)-akridin (kódneve : C—857) ID50 értéke 0,0007 tig ml. II. In vivo eljárások a) A Crocker-féle egér-szarkóma (Sa—180) növekedésének gátlása A kísérlethez 3 hónapos, mintegy 25 g súlyú egereket használtunk. Az egereket az Sa—180 jelű daganat egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
