182276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makromolekulárissá alakított adenin-származékok előállítására
182276 8 A keletkezett NADH-származék 340 nm hullámhossznál végzett spektrofotometriás meghatározásából azt az eredményt nyerjük, hogy a polimer minden grammja 157 mikronról enzimesen redukálható NAD-ot kötött meg, ez a polimerhez kötött összes NAD 90%-ának felel meg. Az ily módon előállított, makromolekulárissá alakított NAD több dehidrogenázzal szemben mutat koenzim-aktivitást. 7 6. példa Nikotinsavamid-8-(3'-aminohexil-szefarozU-3'-oxo-propil-tio)-adenin-dinukleotid I általános képletű vegyület, ahol n=2, az —N = az aminohexil-szefaróz 4B-ből levezethető csoport, és B a NAD- ból levezethető csoport. 500 mg aminohexil-szefaróz 4B-t (Pharmacia AB, Uppsala, a gyanta 6—10 pm hexilamincsoportot tartalmaz miként) 0,5 mólos nátrium-klorid-oldattal duzzasztunk, utána kimossuk 200 ml 0,5 mólos nátrium-klorid-oldattal, majd vízzel. Az ily módon nyert gélt 2 ml vízzel homogenizáljuk, majd hozzáadunk 40 mg nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinukleotid (II általános képletű vegyület, n = 2, az A általános képletű csoport a NAD-ból levezethető csoport) 0,5 ml vízzel készült oldatát, és 1 mólos nátrium-hidroxid-oldat segítségével 4,7-re állítjuk be az oldat pH-ját. A szuszpenzióhoz szobahőmérsékleten, állandó keverés mellett hozzáadjuk 40 mg N-etil-N'-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid 0,2 ml vízzel készült oldatát, majd 24 órán át kevertetjük az elegyet, az első három óra alatt 0,1 mólos sósavoldat esetenkénti hozzáadásával 4,7-es értéken tartjuk az elegy pH-ját. Ugyanilyen körülmények között, 24 órán időközökben még háromszor 40 mg fenti karbodiimid 0,2 vízzel készült oldatát adjuk az elegyhez, így a reakció összideje: 96 óra. Ezután kiszűrjük a gélt, és 1 mólos nátrium-klorid-oldattal és 10 * mólos sósavoldattal mindaddig mossuk, míg a mosóié már nem mutat UV-abszorpciót (nem kötött NAD). Ily módon nedves gél formájában 1,8 ml polimer NAD-származékot nyerünk, 276,5 nm. A termék UV-spektrumát oly módon vesszük fel, hogy 50 súly%-os vizes szaccharóz-oldatban szuszpendáljuk a gélt, ebben a gél csak lassan ülepszik ki. A polimerhez kötött összes NAD mennyiségét oly módon határozzuk meg, hogy méijük a 276,5 nm hullámhossznál észlelhető abszorpciót, és feltételezzük, hogy extinkciós koefficiense azonos a II általános képletű NAD-származékával (e= 18 800 mól • cm "'). A polimerhez kötött, koenzim-aktivitást mutató NAD-származék mennyiségét élesztőből kivont alkohol dehidrogenázzal a gél 0,1 mólos koncentrációjú trisz-pufferoldatot tartalmazó 50 súly%-os vizes szacharózoldattal készült szuszpenziójában, pH=9-nél, 0,2 mól etanol és 0,5 mól szemikarbazid-hidroklorid jelenlétében végzett kvantitatív enzimes redukció útján határozzuk meg. A keletkezett NADH-származék 340 nm hullámhossznál végzett fotometriás meghatározásából azt az eredményt nyeljük, hogy a száraz polimer minden grammja 21 mikromól enzimesen redukálható NAD-ot kötött meg, ez a polimerhez kötött összes NAD 90%-ának felel meg. 7. példa Nikotinsavamid-8-(3'-poIietilénimino-3'-oxo-propiltio)adenin-dinukleotid-foszfát I általános képletű vegyület, n=2, —N=a polietiléniminből levezethető csoport, és B a NADP-ből levezethető csoport. 0. 38 ml, tömény sósavoldattal 5-ös pH-értékre beállított, 33 vegyes %-os vizes polietilénimin-oldathoz (lásd 4. példa) 20 mg nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinukleotid-difoszfát (II általános képletű vegyület, n = 2, és B a NADP-ból levezethető csoport) 0,5 ml vízzel készült oldatát és 20 mg N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid 0,2 ml vizzel készült oldatát adjuk. 2 mólos sósavoldat segítségével 4,8-ra állítjuk be az oldat pH-ját, és 24 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük, az első három órában 0,1 mólos sósavoldat esetenkénti hozzáadásával 4,8-as értéken tartjuk az elegy pH-ját. Ugyanilyen körülmények között hozzáadunk ezután további 20 mg fenti karbodiimid 0,2 ml vízzel készült oldatát, majd további 24 órán át keverjük az elegyet. Vízzel 10 ml-re egészítjük ki az oldat térfogatát, áttöltjük egy centrifuga-csőbe, és 10 ml 1 mólos foszfát pufferoldattal pH = 6-nál kicsapjuk a terméket. 10 percen át 39 000 g-vel centrifugáljuk a szuszpenziót, majd dekantálás útján eltávolítjuk a polimer csapadék fölött lévő oldatot. További tisztítás céljából 2 mólos nátrium-hidroxi-oldatban és 0,05 mólos, 5,5-ös pH-jú acetát pufferoldatban oldjuk a terméket, 8 ml vizzel kiegészítjük az ily módon nyert oldatot, és 10 ml 1 mólos, 6-os pH-jú foszfát pufferoldattal újra kicsapjuk a polimert. 10 percen át 39 000 g-vel centrifugáljuk, majd dekantálás útján elkülönítjük a polimert. Legalább négyszer megismételjük ezt a tisztítási műveletet. 2 mólos nátrium-klorid-oldatban és 0,05 mólos, 5,5-es pH-jú acetát pufferoldatban újra feloldjuk a terméket, és 4 napon át, az oldatokat naponta cserélve, 1—1 liter 10 mólos sósavoldattal Szemben dializáljuk. Fagyasztva szárítjuk a dialízis maradékát, ily módon 83 mg polimer NADP-származékot nyerünk, 276,5 nm. A polimerhez kötött öszszes NADP mennyiségét oly módon határozzuk meg, hogy mérjük a 276,5 nm hullámhossznál észlelhető abszorpciót, és feltételezzük, hogy extinkciós koefficiense azonos a megfelelő NAD-származékéval (e: 18 800 mól-1 • cm-1). A polimerhez kötött, koenzim-aktivitást mutató NADP- származék mennyiségét élesztőből kivont glükóz-6-foszfát-dehidrogenázzal 7,6-es pH-jú, és 6,7 millimól magnéziumkloridot és 1,2 millimól glükóz-6-foszfátot tartalmazó, 86,3 millimólos trietanol-amin-pufferoldatban végzett kvantitatív enzimes redukcióval határozzuk meg. A keletkezett NADP- származék 340 nm hullámhossznál végzett spektrofotometriás meghatározásából azt az eredményt nyerjük, hogy a polimer minden grammja 23 mikromól enzimesen redukálható NADP-t kötött meg, ez a polimerhez kötött összes NADP 20%-ának felel meg. Az ily módon nyert, makromolekulárissá alakított NADP több dehidrogenázzal, mint például a 6-foszfoglükonát-dehidrogenázzal vagy az L-glutamát-dehidrogenázzal szemben koenzim-aktivitást mutat. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az I általános képletű — ahol n 0 és 3 közötti egész szám, B valamely ismert adenin-származékból levezethető cso-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
