182267. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-15003 P-3 antibiotikum előállítására
13 182267 14 a tenyésztést 48 órán át végezzük, 28 °C-on 100/perc levegőztetés, 200 min-1 fordulatszámú kevertetés mellett. A fentiek szerint kapott oltóanyagot 100 liter termelőtáptalajba oltjuk (5% dextrin, 3% kukoricalekvár, 0,1% pepton, 0,5% kalciumkarbonát, pH=7,0), 200 literes saválló fermentorban, és a tenyésztést először 48 óráig végezzük 28 °C-on, 1/1 levegőztetés és 150 min-1 kevertetés mellett. 48 órás tenyésztés után annyi izobutil-alkoholt adunk a tenyészetbe, hogy az izobutil-alkohol koncentrációja 0,1 térfogat% legyen a táptalajban, és a tenyésztést még 48 óráig folytatjuk. A C-15003 összmennyisége 20 mg/1, a P-3 aránya 96 súly%-a a teljes C-15003-nak. Ugyanilyen körülmények között, de izobutil-alkohol adagolása nélkül a C-15003 mennyisége 12 mg/1, és a P-3 aránya 65 súly%. 3. példa 40 ml következő összetételű táptalajt: 3% oldható keményítő, 0,2% ammónium-klorid, 0,05% magnézium-szulfát, 0,05% kálium-klorid, 1,09% kálium-dihidrogén-foszfát, 2,09% dikálium-hidrogén-foszfát és 0,001% vas(Il)-szulfát, beoltunk 1 ml, az 1. példában leírt oltóanyaggal, és izobutil-alkoholt és/vagy izobutir-aldehidet adunk hozzá a 6. táblázatban összefoglalt körülmények között. A 28 °C-on 8 napig végzett tenyésztés eredményeit a 6. táblázatban láthatjuk. 6. táblázat Adagolt anyag és koncentrációja Adagolás időpontja Termelt ősszmenynyiség (Hg/ml) A P—3 aránya (s%) izobutil-alkohol 0,05% 0 27 91 izobutil-alkohol 0,05% 48 29 95 izobutil-alkohol 1,00% 72 7 97 izobutil-aldehid 0,07% 0 24 92 izobutil-aldehid 0,07% 48 23 90 izobutil-aldehid 1,00% 72 4 96 izobutil-alkohol 0,04% izobutil-aldehid 0,04% 48 28 94 nincs adagolás — 10 58 4. példa A 3. példában leírt módon izobutil-alkoholt vagy izobutil-aldehidet adunk a táptalajba tenyésztés előtt. A 7. táblázatban látható eredményeket kaptuk. 7. táblázat Adagolt anyag Koncentráció (térf.%) A termék összmenynyisége Ug/ml) P—3 aránya (°/o) izobutil-alkohol 0,01 24 74 izobutil-alkohol 0,02 27 79 izobutil-alkohol 0,05 27 92 izobutil-alkohol 0,1 8 92 izobutil-alkohol 0,2 2 95 izobutil-aldehid 0,01 18 75 izobutil-aldehid 0,02 21 79 izobutil-aldehid 0,05 28 87 izobutil-aldehid 0,1 20 95 izobutil-aldehid 0,2 5 97 Nincs adagolás — 9 58 5. példa 40 milliliter következő összetételű: 3% oldható keményítő, 0,1% Proflo (Traders Oil Co., USA), 0,2% ammónium-klorid, 0,05% magnézium-szulfát, 1,09% kálium-dihidrogén-foszfát, 2,09% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,001% vas(II)-szulfát, és 0,05% izobutil-alkohol ; termelő-táptalajt 2 ml, az 1. példa szerint készült oltóanyaggal beoltunk, és a tenyésztést 28 °C-on 8 napig végezzük. Tenyésztés után a C-15003 antibiotikum összmennyisége 38 mg/1, és a P-3 aránya körülbelül 95 sűlyszázalék. 6. példa A 2. példában kapott 95 liter tenyészléhez 50 liter acetont adunk, a keveréket 30 percig kevertetjük, majd 2 kg Hyflo Super Cel-t (Johnes and Manville Products, USA) adunk a keverékhez. Alapos keverés után a keveréket nyomás alatt szűrjük, így 120 liter szűrletet kapunk. A szűrlethez 50 liter vizet adunk, majd 90 liter etil-acetátot, és a keveréket extraháljuk. Ezt az eljárást kétszer megismételjük. Az etil-acetátos fázisokat összegyűjtjük, mossuk kétszer 30 liter vízzel, 1 kg vízmentes nátrium-szulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 milliliterre bepároljuk. A sűrítményhez petrolétert adunk, és a kapott csapadékot szűréssel kinyerjük (58 g). Ezt a nyers terméket 50 milliméter etíl-acetáttal kevertetjük, és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. A szűrletet 10 g szilikagéllel (E. Merck, NSZK, 0,05—2 mm) összekeverjük, és az etil-acetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 500 milliliteres szilikagél oszlop tetejére visszük. Az eluálást lépésekben hajtjuk végre 500 ml n-hexánnal, 500 ml n-hexán és etil-acetát 3 : 1 arányú elegyével, 500 ml n-hexán és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyével és 2 liter vízzel telített etil-acetáttal. Az eluátumot 50 milliliteres frakciókban gyűjtjük, és az aktív frakciókat a következőképpen határoztuk meg : minden frakcióból egy millilitert szárazra párolunk, és 0,1 ml etil-acetátot hozzáadva kapunk egy oldatot. Ezt az oldatot csöppentjük fel 2,5 centiméterre egy szilikagél-üveglemez (E. Merck, NSZK, 60 F254’ 0,25 mm, 20 x 20) alsó végétől, és vízzel telített etil-acetátos rendszerrel futtatjuk körülbelül 17 cm-ig. Futtatás után a P-3-at ultraibolya fény alatt (2537 Â) azonosítjuk (Rf érték körülbelül 0,42). Az aktív frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson kb. 20 milliliterre pároljuk be. Ehhez a sűrítményhez adunk 200 ml petrol-étert, és így kapunk 15 g nyers kristályos anyagot. Az így nyert nyers, kristályos anyagot melegítés közben 20 ml etil-acetátban oldjuk, az oldatot lehűtjük, melyből így kiválnak a kristályok. Szűrés után 1,4 g tiszta, kristályos anyagot kapunk, a P-3-ból, olvadáspontja 189—190 °C (97 súly% tisztaságú), és az elemanalízis talált értékei : C: 60,10%; H:7,00%; N:4,30%; Cl: 5,43%. 7. példa A 3. példában leírt módon izobutil-propionátot, izobutil-butirátot vagy izobutil-izobutirátot adagolunk 42 órás tenyésztés után, és a tenyésztést folytatjuk. A kapott eredmények a 8. táblázatban láthatók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
