182255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikofenolsav-származékok előállítására
7 182255 8 Az 1. példában ismertetett módon állítunk elő mikofenolsavglükozidot, azzal az eltéréssel, hogy az S. aureofaciens-t az AJ pontban ismertetésre kerülő fermentációs közegben tenyésztjük. 2. példa A) S. aureofaciens fermentációja S. aureofaciens NRRL 2209 enzimet ferde agaron tenyésztünk, amelyet Bennett-féle közegből készítünk. A tenyészetet elkülönítjük és 10 ml ionmentesített steril vízzel feliszapoljuk. A szuszpenziót elosztjuk négy darab 500 ml-es rázólombikban, amelyek mindegyike 100—100 ml alábbi összetételű vegetatív közeget tartalmaz: Alkotóanyag Menny iség (g/1 (NH4)2HP04 10,0 K2HP04 5,0 Na2S04 0,5 MgS04.7 H20 0,4 FeS04.7 H20 0,02 MnS04.1 H20 0,015 NaCl 0,02 H3B03 0,0005 CuS04.5 H20 0,0004 Na2Mo04.2 H20 0,0002 ZnS04.7 H20 0,008 CaCl2 0,05 CoC12.6 H20 0,0002 élesztőkivonat 1,0 glükóz* 10,0 ionmentesített víz szükséges mennyiség 1 literre * A glükózt külön sterilizáljuk és közvetlenül a beoltás előtt adjuk az S. aureofacienshez. A négy beoltott lombikot 30 C°-on inkubáljuk egy 250 ford/perc sebességű rotációs rázóban 48 óra hosszat. Ezt a vegetatív közeget (5 ml-es adagokban) használjuk a rázólombikok (amelyek 500 ml-esek) beoltására, amelyek 100—100 ml megadott fermentációs közeget tartalmaznak és amelyben ezek összetétele megegyezik a megadott vegetatív közegnek az összetételével. A beoltott közeget 48 óra hosszat inkubáljuk. 3. példa Mikofenolsavglükozidot az 1. példában leírt módon állítunk elő, azzal az eltéréssel, hogy enzimként a Streptomyces candidus NRRL 5449 által az A) pontban leírt módon termelt enzimet használjuk. A) Az S. candidus fermentációja Az S. candidus NRRL 5449 agar ferdetenyészeten fejlődik, amelyet Bennett-féle közegből készítünk, és jól meghatározott kolóniát ad. A kolóniát elkülönítjük és 10 ml steril ionmentesített vízzel feliszapoljuk. Ezt a szuszpenziót négy darab 500 ml-es rázólombikba osztjuk el, amelyek mindegyike 100—100 ml vegetatív közeget tartalmaz, amelyek összetétele a következő: Alkotóanyag Mennyiség oldható kukoricakeményítő* * 25,0 g laktóz 10,0 g maltóz 10,0 g FeS04.7 H20 0,0f g MgS04.7 H20 2,0 g KH2P04 2,0 g CaC03 2,0 g ionmentesített víz szükséges mennyiség 1 literre A négy beoltott lombikot 30 C°-on inkubáljuk egy 250 ford/perc sebességű rotációs rázóban 24 óra hosszat. Ezt a vegetatív közeget használjuk (10 ml-es adagokban) 500 ml-es olyan rázólombikok beoltására, amelyek 100—100 ml következő összetételű sterilizált fermentációs közeget tartalmaznak : Alkotóanyag Mennyiség marhahús-kivonat 5 g kazein hasnyálmirigy pepton-hidrolizátum 5 g NaCl 5 g glicerin 15 g CaC03 2 g ionmentesített víz szükséges mennyiség 1 literre kiegészítve, pH 7,2, nem beállított. A beoltott közeget 72 óra hosszat inkubáljuk a fent leírt módon. 4. példa Mikofenolsavglükozid előállítása egy S. candidus enzim segítségével 5. candidus NRRL 5449 enzimet a 3. példában leírt módon tenyésztünk. A sejteket vákuumszűréssel elkülönítjük a fermentációs közegtől és 200 g-os egyenlő mennyiségekre osztjuk, amelyeket fagyasztva tárolunk. Ezek közül kettőt szobahőmérsékleten megolvasztunk és 0,05 mólos foszfát-pufferben (pH 5,8) szuszpendáljuk és 600 ml végső térfogatra állítjuk be. A sejtszuszpenziól 30 percig ultrahanggal kezeljük, majd 10 000 ford/perc sebességű centrifugában 30 percig centrifugáljuk. A keletkező sejttörmeléket 100 ml foszfát-pufferben szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 18 óra hosszat 5 liter lehűtött foszfát-pufferrel dializáljuk. Az ily módon dializált különleges enzim 50 ml-éhez D-glükózt és mikofenolsavat adunk etanolban oldva. A reakcióelegyet 72 óra hosszat 30 C°-on keverjük és utána szűrjük, majd a szűrletet kloroformmal extraháljuk. A kloroformos kivonatot vákuumban betöményítjük és utána kromatográfiás úton tisztítjuk. Ily módon mikofenolsavglükozidot kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
