182234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertések gastroenterítise elleni vakcina előállítására
182234 6 25 000, és a „B” sáv másik proteinjének molekulasúlya 32 000. Mint már említettük, a találmány szerinti eljárással előállított SPA immunogén nem tartalmaz TGE vírust, Keverékben lehet azonban a „B” sáv szerinti, azonos fajsúlyú másik vírusproteinnel. Kívánatos azonban a további tisztítás, hogy a végső vakcina-immunogén lényegileg teljesen az SPA proteinből álljon. Előnyös, ha az immunogén proteintartalmának 90%-a vagy ennél több SPA protein, amely vízoldható, fajsúlya 1,02—1,03 g/ml és töltés-semleges elektroforetikus mobilitása (Rf-értéke) 1,84 ±0,01 a humán szérumalbuminra vonatkoztatva. Az SPA immunogént jól ismert eljárásokkal elkészíthetjük vakcina-dózis formájában. Parenterális beadás, így intramuszkuláris injekció céljára az SPA-t megfelelő adjuvánssal kombináljuk. Azt tapasztaltuk, hogy megfelelő adjuváns az alumínium-hidroxid. Az alumínium-hidroxid adjuvánsok előállíthatok például a 3 149 036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint, de beszerezhetők a kereskedelemből is, így a Merck Adjuvant 65 (Merck and Co., Inc., Rahway, N. J., USA). Más standard adjuvánsokat is használhatunk, mint például a Freund-féle inkomplett adjuvánst, amely beszerezhető a Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA intézettől. Az SPA immunogén és az adjuváns relatív aránya változtatható, feltéve, hogy mindkettő hatékony mennyiségben van jelen. így az alumínium-hidroxid adjuváns mennyisége a vakcinakeverékben például 0,5% (Al203-ra számítva). Egy dózisra az SPA immunogén koncentrációja 0,25—4,0 mg, előnyösen 0,5—3,0 mg. Jó eredmények érhetők el vemhes kocáknál a malac-ivadék védettségének elérésére dózisonként például 1,0—2,0 mg SPA izomba oltásával. A szokásos dózisnagyság körülbelül 1,0 ml. így az izomba oltott jellemző dózis 1,0 ml, amely 1,0 mg SPA és 0,5% alumínium-hidroxid adjuváns keverékét tartalmazza. Hasonló dózisformák készíthetők malacok parenterális oltásához, de ilyenkor a beadott SPA mennyisége dózisonként kisebb lehet, például 0,25—1,0 mg egy dózisra. Az SPA immunogént bélben oldódó orális vakcina formájában is elkészíthetjük, amint ezt a 3 823 228 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. Az SPA vakcinák hatásmechanizmusa még nincs teljesen felderítve. Ami a malacok passzív immunizálását illeti, úgy látszik, hogy ez a vemhes kocát stimulálja a szükséges immunizáló antitest termelésére az előtejben és a tejben. Mivel azonban az SPA molekulák kis méretűek, lehetséges, hogy bizonyos mennyiségű SPA a placentán keresztül a malacba kerül, ily módon stimulálva a malacban az immunitás közvetlen kialakulását a fialás előtt vagy közvetlenül utána. A vakcina nemcsak igen hatásos ilyen passzív immunizálás szempontjából, de az is előnye, hogy használata teljesen veszélytelen. Nincs lehetőség arra, hogy a vakcina TGE fertőzést okozzon, mint ahogy az élő, virulens TGE vírus használata esetén előfordulhat. Összehasonlítva továbbá az attenuált, nem virulens TGEV törzsekből készített TGE vakcinákkal, az SPA vakcinák sokkal hatásosabbak a malacok paszszív immunizálására. Egy másik fontos előnye az SPA vakcináknak, hogy felhasználhatók a TGE teljes kiirtási programjának részeként. Az SPA vakcináció következtében termelődött antitesteket meg lehet különböztetni a természetes TGE fertőzéskor keletkező antitestektől, 5 így a fertőzött sertést meg lehet különböztetni az immunizált, vakcináit sertéstől. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről a példákkal szemléltetjük. 1. példa A találmány szerinti vakcina készítéséhez szolgáló TGE—SPA immunogént a következőképpen állítjuk elő : 1. A TGEV-t a virulens Illinois-i TGEV törzsből állítjuk elő, amelyet SPF (meghatározott patogéntől mentes) malacok vékonybelében tenyésztünk (a malacokat 48 órás korukban megfertőzzük, a vírust általában a fertőzés után 48 óra múlva gyűjtjük össze). A fertőzött malacok megőrölt éhbeléből 20%-os szuszpenziót készítünk Eagle MEM (minimum essential medium) tápfolyadékban, amelyhez 5% laktalbumin-hidrolizátumot, 2% embrionális sertésszérumot és antibiotikumokat adunk. Más módon eljárva az Illinois-i törzset sertés-heresejt hengeres kultúráiban (roller cultures) tenyésztjük. A sejtek 6 naposak (passzázs után), egyrétegűek a befertőzéskoi, és a vírust a beoltás utáni harmadik napon gyűjtjük össze. Magasabb vírustitereket kaphatunk idősebb sejtekkel (6-8 naposak), mint a fiatalabbakkal (3-5 naposak). Ez különösen olyan TGE vírus törzseknél (mint pél dául az Illinois-i) fontos, amelyek nincsenek jól adaptálva az in vitro körülményekhez. A vírust a sejtkultúra két fagyasztás-olvasztás ciklusa után különítjük el. 2. A nyers vírust körülbelül 5000 g mellett 20—30 percig centrifugáljuk a sejt- vagy béltörmelékek eltávolítása céljából. 3. A vírust 7% polietilénglikol-6000 és 2,3% nátrium-klorid hozzáadásával kicsapjuk a felülúszóból. A keveréket 40 °C-on tartjuk 1,5—2,5 órán át, s így a kicsapódást teljessé tesszük. 4. A csapadékot 9500 g mellett 30 percig centrifugálva összegyűjtjük. A csapadékot 7,0 pH-értékű Eagle MEM oldatban diszpergáljuk, az oldat az eredeti térfogat 1/20-ának megfelelő mennyiségű. 5 A diszperziót sebességzónás centrifugálásnak vetjük alá, szakaszos (10, 25, 40% szacharóz) szacharózsűrűséggrádiensen (trisz-EDTA-val pufferolt izojóniás konyhasóoldatban, pH=7,4) 100 000 g mellett 1,5 órán át. A vírus fajsúlya 1,122 g/ml, és a 25—40%-os szacharóz határfelületre ülepszik. 6. A vírustartalmú sávot leválasztjuk és ultrahanggal kezeljük 10 másodpercig, alacsony teljesítményű, Biosonic IV Sonic Oscillatort használva, így a vírusprotein lehasad a TGEV-ről (a levált protein a vizes fázisban feloldódik). A szuszpenziót ezután trisz-EDTA-val pufferolt izotóniás konyhasóval (pH=7,4) szemben dializáljuk, s így a szacharózt eltávolítjuk. 7. Az oldott vírusproteint tartalmazó szuszpenziót izopiknikus centrifugálásnak vetjük alá, folyamatos (10--60% szacharóz) szacharóz-sűrűséggrádiensen, 260 300 g mellett, 18—20 órán át. A TGE vírus fajsúlya 1,18 g/ml (körülbelül 42% szacharóz). A szükséges proteins áv („B” sáv) fajsúlya 1,02—1,03 g/ml (6—8% szacharóz). A „B” sáv proteinjét vizes oldatként kapjuk, és ezt használjuk a vakcina készítéséhez. 8. A „B” sáv oldatából nitrogénmeghatározást végzünk, így megkapjuk az összes proteintartalmat, s ily módon a proteinkoncentrációt arra az értékre tudjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
