182005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens alfa-amiláz meghatározására

182.005

2. példa

Meghatározás a maltóz~foszforiláz rendszerrel.

Két reagenst készítünk, amíláz-szubsztrátból éa a maltóz-f oszf or Ház-rendszerből. Az egyik reagens malto-heptaóz-szubsztrátot tartalmaz, a másik a technika állásának megfelelően oldható keményítőt. A reagens-konoentráoió a vízben történő feloldás után a következő:

találmány összehasonlítás

Foszfátpuff er NAD

Maitoheptaóz Oldható keményítő Glükóz-1,6-difoszfát Maitóz-foszforiláz

20 mmól; pH 6,5 2 mm ól 10 mmól

nyomnyi 5 egység/ml

/mi kx oor g an 1 zmus b ól/

ft-Foszfo-glükomutáz 1 egység/ml

/ ml kroQX g an izmusból/ ................

G6PDH /Leuconostoo mesent./ 9 egység/ml 6PGDH /Leuconostoo mesent./ 1 egység/ml

20 mmól; pH 6,5

2 mmól

5 mg/ml nyomnyi

3 egység/ml

1 egység/ml

9 egység/ml 1 egység/ml

A kapott oldatot 50 °C-on inkubáljuk, elegyítjük a mintaoldattalj és egy fotométerben Hg 334- nrn-nél meghatározzuk az extinkeiokülönbséget. Az extlnkciókülönbséget 10 perces előlnkubálás után 10 percen át mérjük.

2,0 ml reagens és 0,10 ml minta esetén a következő számi»tásl képletet használjuk:

___ .... , 2,1 x 1000 .

/Wpei’c x 6~~^8x0~~lx0 2 s £&/]?exo x 3-699 egység/1.

öt különböző*humán szarum mérésekor a fenti reagensekkel a következő eredményeket kaptuk:

Szérum

találmány

keményítő

1

37,4 egység/1 61,2 egyseg/1

15,3 egység/1

2

27,3 egyseg/1

3

95,1 egység/1

39,1 egység/1

4

114 egys ég/1

44,2 egység/1

5

374 egys ég/1

161 egység/1

3• példa.

OÍ-Amiláz kimutatás f enil-04-maltoheptaozid szubsztráttal.

Fenll-(/rmaltoheptaozidot az oCamiláz fen 11-Ç^-malto-trliádé vagy -tátraiddá hasit, amelyeket O^-glükozidáz fenolra és glükózra bont le. A szabaddá vált fenolt monofenoloxidázzal oxidálva a 3-metil-6-azulfonil~benztiazolon-2-hidrazon'/HSK/ nukleofíl reagenssel vörös színezékké kapcsoljuk, amelynek képződési sebessége arányos a minta amiláz-aktivitásával, és foto— metriásan nyomonkövetkező.

A vizsgálat elve:

l.a/ fenil-O^-maltoheptaozld + HgO fenil-c(-D: -tri-/tetra/-glükopiranozid + maltotetra-/tri/-óz

9