181999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új daganatgátló antraciklin-antibiotikumok előállítására
23 181999 24 1. példa A következő összetételű táptalajt készítjük el : Glükóz 2%, Burgonyakeményítő 2%, „Magbér (Szójababpor, Ajinomoto Co.) 2%, Dikálium-hidrogén-foszfát 0,1%, Magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1%, nátrium-klorid 0,3% mangán-dikl orid-tetrahidrát 0,0008%, réz-szulfát-heptahidrát 0,0007%, vas(II)-szu1fát-heptahidrát 0,0001 %, cink-szulfát-heptahidrát 0,0002%, pH 7,2. E táptalaj 50 ml-ét 120 C°-on 15 percig sterilezzük 500 ml-es lombikban, majd beoltjuk Streptomyces galilaeus MA144—Ml (FERM P—2455, ATCC 31133) 1 ml fagyasztott tenyészetével és 30 C°-on 48 óráig rotációs rázógépen inkubáljuk. 20 literes rozsdamentes acél-fermentorban levő, előzetesen sterilezett 10 liter táptalajt csíramentesen beoltunk a fenti törzstenyészet 200 ml-ével. A fermentációt 20 C°-on 18 óráig folytatjuk keverés (300 fordulat per perc) és levegőztetés (5 liter per perc) közben. Ezután a tenyészet 10 literét átvisszük egy második rozsdamentes acéltartályban levő, előzetesen sterilezett 600 liter táptalajba és a tenyésztést 28 C’en 36 óráig folytatjuk keverés (180 fordulat per perc) és levegőztetés (300 liter per perc) közben. A kapott 500 liter tenyészlé pH-ját kénsavval 5,0-re állítjuk be és a diatomafölddel leszűrjük. A kapott szűrőpogácsát (56 kg) 50 liter acetonban szuszpendáljuk és 1 órai keverés után leszűrjük. Az üledéket újraextraháljuk 50 liter acetonnal. Mindkét kivonatot csökkentett nyomáson 25 literre bepároljuk, 20 liter etil-acetáthoz adjuk és keverjük. Az etil-acetátos réteget elválasztva csökkentett nyomáson 1 literre bepároljuk, a nyers MA144 keveréket 15 liter n-hexán hozzáadásával kicsapjuk, majd kétszer n-hexánnal kimosva 36 g piros port kapunk. Másrészt a fent kapott tenyészlé-szűrlet pH-ját nátrium-hidroxiddal 6,8-ra állítjuk be és 100 liter toluollal extraháljuk. A kivonatot csökkentett nyomáson 10 liter térfogatra bepároljuk és újraextraháljuk 10 liter pH 3,5-ös acetátpufferrel. A kapott vizes réteg pH-ját 6,8-ra állítjuk be, 4 liter toluollal újraextraháljuk és csökkentett nyomáson 30 ml-re bepároljuk. A nyers MA 144 keveréket a koncentrációból 300 ml n-hexán hozzáadásával kicsapjuk és így 2,5 g piros port kapunk. ■ 2. példa Az 1. példában leírtak szerinti szűrőpogácsából kapott MA144 keverék nyers porát (10 g) feloldjuk 100 ml toluolban és 300 g szilikagéllel megtöltött oszlopra viszszük fel (5x40 cm), majd az első, 1,5% metanolt tartalmazó toluolos eluátumot elöntve az MA144—Gl, —G2 és —L frakciókat egymás után eluáljuk 2% metanolt tartalmazó toluollal. Ezután az MA144—NI frakciót 3% metanolt tartalmazó toluollal és az MA144—-SÍ és —S2 frakciókat és az MA144—U1 és —U2 frakciókat egymást követően 5% metanolt tartalmazó toluollal eluáljuk. Az így kapott összes frakciót bepároljuk, majd n-hexánt hozzáadva 210 mg MA144—Gl és —G2 keveréket kapunk nyers narancsvörös por alakjában, továbbá 190 mg MA144—L-t, 570 mg MA144—NI és rhodirubinA keveréket, 360 mg MA144—SÍ és —S2 keveréket, 270 mg MA144—U1 és —U2 keveréket. 3. példa Az 1. példában kapott táptalaj-szűrletből kinyert MA144 keverék 2,5 g nyers porát 6 ml toluolban oldjuk, 100 g szilikagélt tartalmazó oszlopra visszük fel, majd az MA144—Y frakciót 1,7% metanolt tartalmazó toluollal eluáljuk 5 C°-on. A kapott frakciót csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és 400 mg nyers MA 144—Y-t kapunk narancs vörös por alakjában. 4. példa A 2. példában kapott 210 mg MA144—Gl és —G2 keveréket kevés etil-acetátban oldjuk és 30 g „Column Lite”-et (szilikagél-márkanév, Fuji Chem. Co.) tartalmazó oszlopra visszük fel és etil-acetát/metanol 1 : 1 eleggyel eluáljuk. A sárga frakciót csökkentett nyomáson szárazra párolva maradékot 50 ml kloroformban oldjuk, 10~3 mól EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsav) tartalmazó 50 ml 0,01 mólos foszfátpuíferrel rázzuk a fémionmaradványok eltávolítása céljából, a kloroformos réteget kétszer vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 110 mg MA144—Gl-et kapunk sárga por alakjában. A fenti Column-lite oszlopot a sárga frakciók elúciója után 10-3 mól EDTA-t tartalmazó 30%-os alkohollal mossuk, és a keletkezett vörös eluátumot szárazra pároljuk, kis mennyiségű kloroformban oldjuk és a viszszamaradt fémionokat a fent megadott módszerrel eltávolítva 22 mg MA144—G2-t kapunk vörös porként. (EDTA=etiléndiamin-tetrae cetsav). A 2. példában kapott nyers poralakú MA 144—L-t a fentiekben az MA144—Gl kezelésénél leírt módon dolgozzuk fel, és így 115 mg MA144—L-t kapunk sárga por formájában. Az MA144—Gl és —G2 finomításánál leírtak szerint eljárva 260 mg MA144—NI, 150 mg MA144—SÍ, 88 mg MA144—S2, 128 mg MA144—U1 és 54 mg MA144—U2 és 114 mg MA144—Y terméket nyerünk tiszta porként. 5. példa Az 1., 2. és 4. példa általános módszerével a jelzett Streptomyces törzsekből a következő találmány szerinti vegyületeket állítjuk elő : 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
