181957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló fehérje jellegű antigén preparátumok előállítására
7 181957 8 tográfiás oszlopon engedjük át a glükoziltranszferáz enzimek eltávolítása céljából, melyek hajlamosak a tisztítás során is együtt maradni az antigén B-vel. Az oszlopot McCabe és Smith szerint készíthetjük el (Infect. Immun., 16,760—765, [1977]). Az oldathoz lassan szilárd ammónium-szulfátot adunk a 45%-os telítettség eléréséig, majd egy éjszakán át 4 °C-on állni hagyjuk és a képződött csapatot centrifugálással elkülönítjük. Az előzetes kísérletek fît mutatták, hogy az antigén B legjobban a 45%-ra telített áhímónium-szulfát oldatban csapódik ki, míg az antigén A kicsapódásához legelőnyösebb a 65%-ra telített ammónium-szulfát oldat. Az oldathoz ezért további ammónium-szulfátot adunk a 65%-os telítettség eléréséig, és újra összegyűjtjük a csapadékot. Mindkét frakciót 7,5 pH-jú 50 mM trisz sósav pufferrel szemben dializáljuk a következő lépés, a DEAE térhálósított dextránon való kromatografálás előtt (DEAE Sephadex A25). Végig a tisztítás során ugyanezt a puffert használjuk. A mintákat előzetesen trisz pufferrel ekvilibrált külön oszlopokra visszük fel. Az eluálást úgy hajtjuk végre, hogy az oszlopon keresztül engedünk egy térfogatnyi trisz puffert, majd fokozatosan 0-tól 0,3 M-os trisz pufferes nátriumklorid oldatot. A frakciókat összegyűjtjük és NDS-poliakrilamid lemez gélelektroforézissel és kombinált immunoelektroforézissel analizáljuk NDS-sel extrahált sejtekkel előállított antiszérummal szemben. A 45%-ig telített ammónium-szulfátos oldatból származó antigén B körülbelül 0,8 M nátrium-kloriddal eluálódik, míg az antigén A körülbelül 0,13 M nátrium-kloriddal eluálódik. Mindkét esetben 90%-ra becsültük az antigén fehérjék tisztaságát. Az antigént tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, trisz pufferrel szemben dializáljuk és ultraszűréssel töményítjük. A részlegesen tisztított antigéneket ezután agaróz gél oszlopra visszük (Sepharose CL—6B) és trisz pufferrel eluáljuk. A frakciókat összegyűjtjük és elemezzük az antigének és a fehérje összetétel szempontjából. A fenti eljárással olyan antigén A és B fehérje preparátumokat kapunk, melyek NDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és poliakrilamid gélen végrehajtott izoelektromos elválasztással tisztának bizonyultak. Ha ezeket a preparátumokat adjuvánsokkal együtt nyulakba fecskendezzük, az NDS-sel extrahált sejtekkel fentebb leírt immunizálási módszert követve, monospecifikus antiszérum termelődik, melynek hatását gélen való lecsapásos módszerekkel nyers antigén készítményeken vizsgálva csak a homológ antigén csapódik ki. Az antigén A-val és B-vel szemben termelődött monospecifikus antiszérumokat felhasználhatjuk az antigének immunoszorbciós affinkromatográfiás tisztítására. Egy tipikus eljárás szerint a szérum immunoglobulin G frakcióját térhálósított agaróz gyöngyökhöz kapcsoljuk (bróm-cianiddal aktivált Sepharose, Pharmacia) a gyártó által javasolt módon. Az oszlopon az Ingbritt-féle Streptococcus mutáns törzs tenyészetének töményített szűrletét engedjük át, 0,05 M-os 7,5 pH-jú trisz sósav pufferben, mely 1% Triton X—100-at tartalmaz. Ezután az oszlopot néhány térfogat trisz pufferrel mossuk, majd 3M nátrium-tiocianátot tartalmazó trisz pufferrel vagy 2,8 pH-jú 0,1 M glicint tartalmazó sósav pufferrel eluáljuk (más eluálószerek is megfelelőek lehetnek). így a kívánt antigének tiszta készítményeit kapjuk. Ha az oszlopról az IgG egy része is eluálódna, ez könnyen elválasztható az antigéntől a már leírt ioncserélő kromatográfiás módszerrel. Az affin módszerrel tisztított antigént 48 óráig 105 °C hőmérsékleten 6N sósavban hidrolizáltuk és meghatároztuk aminosav-összetételét. Az eredményeket az 1. táblázatban tüntettük fel. 1. táblázat Fehérjehidrolizátumok aminosav összetétele Az egyes aminosavgyökök száma (%) antigén A antigén B Aszparaginsav 101 103 Treonin 56 60 Szerin 91 61 Glutaminsav 106 111 Prolin 65 44 Glicin 190 212 Alanin 89 117 Císztin — — Valin 53 58 Metionin — — Izoleucin 38 38 Leucin 61 53 Fenilalanin 28 25 Tirozin — 10 Hisztidin 50 18 Lizin 46 64 Arginin 27 26 Aminocukor 4 4. példa Az antigén- és védőhatás vizsgálata Az antigén A és B kijutnak a baktériumok felszínére és immunogénekként hatnak. Az olyan kísérletek, melyeket néhány tucat nyúl és majom immunizálásával hajtottak végre, megmutatták, hogy az antigén A és B által kiváltott antitest válaszok sokkal erősebbek, mint a más antigének által kiváltottak. Az a hatás még erősebb akkor, ha az állatokat sejtfalban gazdag készítménnyel immunizálják. Mint fentebb leírtuk, az NDS-sel extrahált sejtfalak hatására csak az antigén A és B antitestjei képződnek, míg a kevésbé szelektív extrakciónak alávetett sejtfalak hatására szintén az antigén A és B antitestjeinek képződése a legintenzívebb, de két másik jelenlevő antigén is kivált — gyengébb — immunválaszt. Az antitestek a szokásos módszerekkel, például térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel vagy „reversed-rocket line” elektroforézissel mutathatók ki. Az antitest válasz erőssége meghatározható enzimes immunoszorbens vizsgálattal (ELISA), Voller, Bidwell és Bartlett mikrolemezes módszere szerint (Flowline Publications, 1977). Műanyagból készült Microtiter tálcákat az immunoaffin módszerrel tisztított antigén A-t és B-t körülbelül 1 ug/ml koncentrációban tartalmazó anyaggal vontunk be. Az antigénen megkötődött majom antitest mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy alkáli-foszfatázhoz kapcsolt emberi anti-IgG-vel (Don Whitle Ltd.) inkubáltuk. Az eredményeket vagy úgy fejeztük ki, mint egy titrálás végpontjának értékét (azaz egy hígítási sorozatnak az a tagja, mely egy bizonyos színt mutat), vagy pedig egy bizonyos hígítású szérum minta 405 nm-nél mutatott abszorbanciájának megmérésével. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
