181957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló fehérje jellegű antigén preparátumok előállítására
3 181957 4 ható segédanyagokkal kombinálva. A „gyógyszerkészítmény” kifejezés alatt a megelőzésre alkalmas, profilaktikus szereket, például vakcinákat, és a fertőzést követően, a fertőzés hatásának csökkentésére beadott szereket értjük. Az antigén A molekulasúlya 29 000 ±3000 és izoelektromos pontja 4,1—4,5. A Streptoccus mutáns „C” szerotípusának (Bratthall: Ódont Revy, 20, 231—243, [1969] szerint), melybe például az NCTC 10 449 törzs is tartozik, sejtfalából nyerhető oly módon, hogy a sejteket nátrium-dodecil-szulfát (NDS) 10 g/1 koncentrációjú vizes oldatával extraháljuk szobahőmérsékleten 1 óra hosszat vagy forralás közben 20 percig. Az antigén A a sejtfalban visszamarad. Lényegében azonos fehérjéket találtak más, az I genetikus csoportba tartozó Streptococcus mutáns törzsek sejtjeiben is (Coykendall: J. Gen. Microbiol, 83, 327—338); idetartoznak az „e” és „f” szerotípusok, például a Russell által leírt törzsek is (Microbiol. Letters, 2, 55—59, [1976]). Hasonló antigén fehérjéket találtak más genetikus csoportba tartozó, például „b” szerotípusú törzseknél is. Jelen találmány ilyen antigén fehérjékre vonatkozik, és ezeket foglalja magában a leírásban és az igénypontokban alkalmazott „antigén A” kifejezés. így a találmány szerinti megoldás nincs bizonyos speciális törzsekre korlátozva. Az antigén A-t nem könnyű elválasztani az NDS-sel extrahált sejtfalakból, de nyulak immunizálása az extrahált sejtfal-preparátummal két fehérje, az antigén A és az antigén B antiszérumának keletkezését eredményezi; ezáltal ezek kimutathatók és elválaszthatók a teljes sejtből extrahálással készített anyagból vagy a sejtmentesített szűrletből. Az antigén így egyszerűen előállítható tenyészetek szűrletéből vagy magukból a tenyészetekből előzetes sejtfelbontás után. A találmány szerint az antigén A-t úgy állítjuk elő, hogy Streptococcus mutáns baktériumokat megfelelő táptalajon tenyésztünk, a kapott tenyészetből legalább a baktériumok sejtfalát eltávolítjuk, és a kapott fehérjeoldatból elválasztjuk az antigén A-t. Táptalajként bármely, a Streptococcus mutáns tenyésztésére alkalmas táptalajt használhatunk, például Todd-Hewitt táptalajt (Todd, E. W., Hewitt, L. F.: J. Path, and Bacteriol., 35, 973—974 [1932]), vagy tripton/élesztő extraktot vagy kémiailag előállított, ismert összetételű táptalajt. Ez utóbbi alkalmazása megkönnyíti a termék tisztítását. A tenyésztés folyamán az antigén A folyamatosan keletkezik és a táptalajba jut. A sejteket előnyösen a korai stacionárius fázisban dolgozzuk fel (15—25 óra, 37 °C-on). A sejteket folyamatosan is tenyészthetjük. A fehérjeoldat tartalmazhatja egyszerűen a tenyészet szűrletét, melyet a teljes sejtek eltávolításával nyerünk vagy tartalmazhat a sejtfalaktól és sejttöredékektől megtisztított sejtextraktumot, vagy lehet ezek keveréke, melyet úgy állítunk elő, hogy a tenyészet sejtjeit megbontjuk, majd eltávolítjuk a sejtfalakat és sejttöredékeket. A sejtfalakat eltávolíthatjuk a sejtek egészben való eltávolításával, vagy töredékként a sejt felbontása után, ismert módszerekkel, például centrifugálással vagy szűréssel. Az antigén A-t ismert módszerekkel, előnyösen ammónium-szulfátos lecsapással, majd azt követő kromatografálással nyerhetjük ki a fehérjeoldatból. Az ammónium-szulfátos lecsapást végrehajthatjuk egy lépésben, az oldatot célszerűen 65%-ra telítve, de ennél előnyösebb két lépésben való végrehajtása, az első fázisban 45%-ra, a másodikban pedig 65%-ra telítve az oldatot. Az első lépésben kapott csapadék kis mennyiségű antigén A-t tartalmaz, a második lépésben kapott csapadék tartalmazza az antigén A túlnyomó részét, emellett kisebb mennyiségben más fehérjéket is, például antigén B-t is tartalmaz. Az antigén A-t kromatográfiás módszerrel nyerhetjük ki a második lépésben nyert csapadékból vagy mindkét lépés csapadékából, a gazdaságosságtól függően. A kromatográfiás elválasztást bármely alkalmas anyagon végrehajthatjuk; alkalmazhatunk például térhálósított dextrán vagy agaróz gélt vagy dextránnal szubsztituált triázint agaróz gélen immobilizált formában. Különösen előnyös a dietilamino-etillel térhálósított dextrán alkalmazása. A fehérjéket a szokásos módon, a pH vagy az ionerősség fokozatos változtatásával eluálhatjuk; előnyös az ionerősség nátrium-kloriddal való változtatása, mely esetben az antigén A-t 0,1—0,2 molaritású nátrium-kloriddal eluáljuk. Ezen kívül alkalmazhatunk affinkromatográfiát vagy immunadszorbens-kromatográfiát is az antigén A kinyerésére; kromatografálhatjuk az ammónium-szulfátos lecsapással nyert csapadékot vagy a nyers sejtextraktumot és/vagy a felülúszót. A legelőnyösebb módszer az antigén A elválasztására a fehérjeoldatból az immobilizált anti-antigén A antitestek alkalmazásával végrehajtott affinkromatográfia. Az antitestek lehetnek valamely megfelelő állatban, például nyúlban termelődött immunoglobulin G (IgG) antitestek, melyeket szokásos módszerrel, például térhálósított agaróz gyöngyökön immobilizálunk, majd bróm-cianiddal aktivizálunk. A tisztított antigén A preparátumot a gyógyászatban szokásos hordozó- és segédanyagokkal vakcinává alakíthatjuk; ilyen segédanyagok például az adjuvánsok (például az alumínium-hidroxid), a stabilizáló anyagok és a bakteriosztatikumok. A vakcina a Streptococcus mutáns egy vagy több törzséből származó fehérjéket tartalmaz és embereknek valamint emlős állatoknak beadható szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán vagy szubmukoidálisan, általában 1—50, legelőnyösebben 10 (ug) testsúlykilogramm dózisban. Több injekció beadására is szükség lehet a megfelelő antitest-válasz kiváltásához. Védettséget lehet elérni az orálisan, például az antigént tartalmazó kapszulák lenyelésével végrehajtott immunizálással is. A találmány szerinti, az emlősök fogszuvasodásának megelőzésére vagy gátlására szolgáló készítmény másik formája az antigén A antitestjeit tartalmazza a gyógyászatban szokásos valamilyen formában. A készítmény lehet injekció, vagy formulázható helyi alkalmazásra megfelelő formában, például fogpaszta vagy szájviz alakjában. A készítmény vagy csak az antigén A antitestjeit, vagy más Streptococcus mutáns antigének antitestjeit is tartalmazza. Az antitesteket szokásos módon, Streptococcus mutáns antigén készítményeket — beleértve az antigén A-t is — megfelelő állatokba, például tehenekbe vagy nyulakba fecskendezve állíthatjuk elő. Az alkalmazható antigén készítmények közé tartozik elsősorban az NDS-sel mosott sejtfal-preparátum és a fent leírt módon előállított tisztított antigén A. A leírt találmány szerinti készítmények hatása az antigén A antitestjeinek köszönhető, akár jelen vannak azok a beadott készítményben, akár pedig kezelt szervezetben képződnek immunválasz révén. A fogszuvasodást megelőző antitestek hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott, de ez nem gátolja a találmány gyakorlati alkalmazását. Lehetséges, hogy a szóbanforgó antitestek a baktériumsejtek anyagcseréjét befolyásolják, és a glukán vagy a sav képződését gátolják. A hatásmechanizmusukra vonatkozó egyes feltevések azonban semmiképpen nem befolyásolják a találmány oltalmi körét. Az oltalmi kör továbbá nem korlátozódik a leírásban felsorolt és a példákban említett Streptococcus mutáns fajokra. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
