181756. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergotamin előállítására
5 181756 6 Az új törzsnek az alábbi mikroszkopikus és makroszkopikus tulajdonságai vannak: Makroszkopikus külső A tenyészetek kora: 3 hét agar NL 126 lapos, világos-barna, finomszálú, ráncos gyep. Az egyes telepek 0,8—1,3 cm átmérőjűek, világos-barnák, finomszálúak, ultraibolya fényben enyhén fluoreszkálnak. agar NL 829 Domború kiemelkedő, erősen ráncos gyep, felső oldala szürkés-barna, pereme éles. Az egyes telepek 0,8-1,3 cm átmérőjűek, magasságuk az 1 cm-t is eléri. A kuglóf alakú, élesen elhatárolódó telepek felső oldala szürkés barna, alsó oldala fiatal telepek esetén sárgás-barna, öreg telepek esetén közepesen barna. Ultraibolya fényben fluoreszkálnak. Mikroszkopikus külső Előtenyészet NL 849 sz. tápközegben — 3 napos korban — viszonylag rövid, erősen elágazódó hifák. A hifák többé-kevésbé szeptáltak, erősen szemcsések, 50— —200 jum hosszúak: botszerű megvastagodásokkal, ritkán artrospórákkal rendelkeznek. 10 fim méretű hólyagszerű megvastagodások. Főtenyészet NL 833 sz. tápközegben — 7 napos korban — A micéliumot hosszú, elágazódó hifák képezik. A hifa fala normál, és fel nem tűnő módon szépiáit. A hifák szemcsések, plazmájuk a középen, vagy a fal mentén helyezkedik el. Többnyire a hifa végén hólyagszerű duzzanat. Néha spórák (klamido- vagy artrospórák). A hifák átmérője: 5—7jum, a hólyagszerű duzzanatok átmérője: 8-10 fim. — 14 napos korban — A hosszú, elágazódó hifákból álló micélium erősen szeptált, plazmája a középen vagy a fal mentén helyezkedik el. A hifák átmérője 5-7 fim, bunkószerű elvastagodások átmérője: 8—12 /am. Néhány artrospóra. A micélium lipid-cseppeket tartalmaz, előfordulási arányuk az alkaloida-termelő kultúrákban különösen magas. A tenyészeteket 24 ± 1 °€ hőmérsékleten, rázóasztalon (frekvencia 240 perc-1) inkubáljuk. A termelő törzset aerób módon, folyékony tápközegben úsztatott és/vagy süllyesztett tenyészetben tenyésztjük. A tápközeg asszimilálható szénforrást, például szacharózt, glükózt, mannitot, szorbitot, glicerint, citrom- vagy borostyánkősavat, továbbá asszimilálható nitrogénforrást, például ammóniát, aszparagint, peptont, kazein-hidrolizátumot vagy valamilyen ammóniumsót, végül ásványi sókat tartalmaz. A fermentációt Fernbach- vagy Erlenmeyer-lombikban, rázólombikban vagy fermentorbam végezhetjük. A tenyésztés előnyösen egy-, két- vagy háromlépcsős. Előnyösen a 4-14 napos előtenyészetet 1 :5—1 :20 arányban oltjuk a főtenyészet tápközegébe. A főtenyészetet 7-20 napig inkubáljuk 4,0 és 6.2 közötti pH-érték mellett; a hőmérséklet 20 és 30 °C közötti. Optimális az inkubálás 22—25 °C-on, 5.2 és 5,9 közötti pH-érték mellett. A törzs fenntartása protoplazma-kultúrák vagy védőkolloid alkalmazása mellett végzett mélyfagyasztás segítségével oldható meg. Alkalmas védőkolloid például a 60%-os szacharóz-oldat és a sovány tej 2 :1 arányban készített elegye. A találmányt az alábbi kiviteli példákkal közelebbről megvilágítjuk. 1. példa A Claviceps purpurea (fr.) Túl. IBP 74 törzs konzervált anyagától kiindulva 500 ml-es rázólombikban levő 100-100 ml NL 849 jelű tápközeget beoltunk, és az előtenyészetet 7 napon át 24+1 °C-on 240 perc-1 frekvencia mellett inkubáljuk. A kapott tenyészetek 10%-ával 500 ml-es lombikokban levő 100—100 ml NL 833 jelű közeget oltunk be. A leírt körülmények között 14 napig inkubálva a tenyészet 1450Mg/ml koncentrációban tartalmazza a fent megadott összetételű alkaloidot. 2. példa Az í. példa szerint NL 849 jelű tápközeggel készített előtenyészettől kiindulva ugyanazzal a tápközeggel 1:10 oltási arány mellett második előtenyészetet készítünk elő. Az oltóanyagot 7 napig inkubáljuk, majd fermentorban levő 2 liter NL 833 jelű tápközeget oltunk be: 1:10 arányban, oltóanyagként a második előtenyészetet használva. Hőmérséklet: 24 °C Keverési sebesség: 280-450 perc-1 (a szaporodástól függően) Levegőáram: 0,2—0,65 1/perc (növekvő micélium sűrűségétől függően) 12 nap elteltével a tény észlé 900/rg/ml alkaloidát tartalmaz. 3. példa Az alkaloidák azonosítása céljából mindegyik tény észléből 1—5 ml-t lúgosítunk, majd háromszor kloroformmal extrahálunk. Az extraktumot bepároljuk, a maradékot kevés kloroformban oldjuk, majd preparatív rétegkromatográfia segítségével (Kieselgél, fluoreszcens indikátor) szétválasztjuk az alkaloidákat. Oldószerként kloroform és etanol 9 :1 arányban készített elegyét használjuk. Az alkaloidazónákat a lemezről leemeljük, külön-külön víz, metanol 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
