181721. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-19393Sindex 2-es alul antibiotikumok előállítására
7 181721 előnyösen kevert kultúrákkal dolgozunk szellőztetés alkalmazásával. A mikroorganizmusok tenyésztését általában 15 °C-tól körülbelül 32 °C-ig terjedő hőmérsékleten, körülbelül 4 és 8 közötti pH-értéknél, 8 órától körülbelül 168 óráig, előnyösen 24 órától 144 óráig terjedő időtartammal végezzük. A mikroorganizmusok a C-19393S2 antibiotikum termelését túlnyomórészt extra-cellulárisan végzik, tehát a mikroorganizmus a sejteken kívül, a fermentációs lében gyülemlik fel és ezért a fermentáció befejezése után a mikroorganizmus-sejteket célszerűen elkülönítjük a szupernatáns folyadéktól; az elkülönítés például centrifugálással vagy szűréssel történik. így az antibiotikumot a folyékony fázisból nyerjük ki; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy közvetlenül a teljes fermentlevet dolgozzuk fel a mikroorganizmus kinyerése céljából. A fenti módon termelt antibotikum hatóképességének meghatározását Comamonas terrigena IFO 13299 mikroorganizmussal szemben végeztük; hengeres-lemez módszerrel vagy papírkorong-módszerrel, húsfőzet-agar közegben, vagy pedig a Baltimore Biological Laboratory amerikai cég által gyártott „TSA” (Trypticase Soy Agár) tápközeg felhasználásával. A C-19393S2 antibiotikum elkülönítése ugyanolyan módszerekkel történhet, mint amilyeneket a különféle mikroorganizmusok anyagcsere termékeként nyert egyéb hatóanyagok elkülönítésére általában alkalmazni szoktak. így például, minthogy a C-19393S2 antibiotikumok vízben oldható savas jellegű és legnagyobbrészt extracellulárisan termelt anyagok, az elkülönítés oly módon történhet, hogy a mikroorganizmus-sejteket szűrés vagy centrifugálás útján eltávolítjuk a fermentléből és a szupernatáns folyadékból illetőleg szűrletből nyerjük ki a szokásos tisztítási módszerekkel a C— 19393S2 antibiotikumot. Elkülönítési módszerként a hatóanyagok különböző oldószerekben való különböző oldhatóságának felhasználásán alapuló módszerek, továbbá a lecsapás során mutatott viselkedés vagy a leválási sebesség eltérésein, a különböző adszorpciós affinitáson alapuló módszerek, ioncserélő-kromatográfia, molekulaszűrő-kromatográfia, csökkentett nyomáson történő betöményítés, liofilizálás és hasonlók vagy az említett módszerek különböző kombinációi alkalmazhatók, bármilyen sorrendben és esetleg ismételten. A tisztítás céljaira felhasználható adszorbensek példáiként az aktívszén, adszorbens gyanták, aníoncserélő gyanták, porított cellulóz, szilikagél és hasonlók, továbbá molekulaszűrő-tulajdonságú hordozók említhetők. Eluáló oldószerként vízzel elegyedő szerves oldószerek, mint aceton, metanol, etanol, propanol, butanol, izopropanol, izobutanol és hasonlók vizes oldatai, továbbá savak vagy alkáliák vizes oldatai, pufferoldatok, valamint szervetlen vagy szerves sók vizes oldatai alkalmazhatók; az adott esetben célszerűen alkalmazható oldószer az adszorbens illetőleg hordozó fajtájától is függ. A C— 19393S2 antibiotikum esetében a fermentáció befejeztével a a fermentlevet leszűrjük és valamely szűrési segédanyagot alkalmazunk a mikroorganizmus-sejtek eltávolítása céljából. A kapott szűrletet azután semleges vagy gyengén savas körülmények között egy aktívszén-oszlopon vezetjük keresztül, majd az abszorbeált C-19393S2 antibiotikumot valamely hidrofil oldószer-rendszerrel eluáljuk. Az antibakteriális aktivitás legnagyobb részét a vizes eluátumban találjuk. Minthogy az antibiotikum savas természetű, anioncserélő gyanták, különösen Cl' vagy CH3COO“ típusú anioncserélők, mint Amberlite IRA—400, 402 és 410 (a Rohm & Haas Co. amerikai cég gyártmánya), Dowex-1 (a Dow Chemical Co. amerikai cég gyártmánya) vagy Diaion SA-21A és C (a Mitsubishi Chemical Industries japán cég gyártmánya) alkalmazhatók célszerűen további tisztításra. Az antibiotikus hatóanyagot azután vizes nátrium-klorid-oldattal vagy valamely pufferoldattal eluáljuk a gyantáról. Az eluátum sómentesítése oly módon történhet, hogy az eluátumot gyengén megsavanyítjuk, majd ismét aktívszénen kromatografáljuk, amikor is vizes alkohollal vagy hasonlókkal eluálunk. A hatóanyagot tartalmazó eluátumot azután csökkentett nyomáson és alacsony hőmérsékleten betöméhyítjük és a kapott koncentrátumhoz metanolt vagy etanolt adunk. A képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük és a szűrletként kapott vizes alkoholos oldatot ismét betöményítjük csökkentett nyomáson. A maradékként kapott koncentrátumhoz acetont vagy valamely hasonló szerves oldószert adunk és a képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük. Az így kapott por alakú terméket azután célszerűen oszlop-kromatográfiával tisztíthatjuk tovább, Cl"-alakban levő DEAE vagy QAE Sephadex gyanta (a Pharmacia Co. svéd cég gyártmánya) és XAD adszorbens-gyanta (a Rohm & Haas Co. amerikai cég gyártmánya) vagy Diaion HP-20 nagymértékben pórusos gyanta (a Mitsubishi Chemical Industries japán cég gyártmánya) kombinációjának adszorbensként való felhasználásával. A kapott por alakú termék vizes oldatát tehát egy CP-alakban levő DEAE Sephadex A-25 gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül a hatóanyag adszorbeáltatása végett, azután az oszlopot vízzel mossuk és 0,4 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 pH-értékre állítjuk be, majd aktívszén-oszlopon kromatografáljuk. Az aktívszén-oszlopot vizes izobutanollal eluálhatjuk, de jobb eredményt kapunk, ha semleges vagy gyengén bázisos körülmények között végezzük az eluálást; ebből a célból az oldatot híg vizes ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával állítjuk be a kívánt pH-értékre. Az így kapott anyagot azután XAD-II vagy Diaion HP-20 gyanta-oszlopon kromatografáljuk és az oszlopon adszorbeált hatóanyagot vízzel frakcionáltan eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és betöményítjük, majd a koncentrátumot Cl'-alakban levő QAE Sephadex A—25 gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk és 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluálunk. Az eluátumot azután a fent leírt módon, aktívszenes kromatografálással mentesítjük a sóktól. A kapott eluátumot betöményítjük és ezt a koncentrátumot XAD-II oszlopon kromatografáljuk, majd vízzel frakcionáltan eluálunk. E frakciók között találunk olyanokat, amelyek az alább ismertetett folyadék-kromatogrammon egyetlen csúcsértéket mutatnak. Az ilyen aktív frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson, alacsony hőmérsékleten szárazra pároljuk, majd acetont vagy 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
