181684. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a kreatinkináz mb meghatározására
3 181684 4 Ezt a feladatot egy, a kreatinkináz MB szérumban történő meghatározását az M alegység immunológiai kikapcsolásával és a B alegység kreatinkináz meghatározására ismert módszer segítségével mérő olyan eljárással oldjuk meg, amelyet az jellemez, hogy az M alegységnek a reakcióelegyben történő kikapcsolásához olyan monovalens fragmenseket adagolunk, amelyeket az M alegységgel szembeni antitestekből nyertünk ki redukáló körülmények között végrehajtott proteolitikus hasítással. Ismert, hogy az enzimeket nemcsak azok a természetes antitestek gátolják, amelyek az IgG-frakcióhoz, illetve a 7-globulinokhoz tartoznak és molekulasúlyuk körülbelül 130 000-210 000, hanem az ilyen antitestek proteolitikus hasításakor is olyan fragmensek keletkeznek, amelyek bár a precipitációs képességüket elvesztették, minthogy a divalens antitestekkel ellentétben csak monovalensek, azonban a monovalens fragmensek gátló tulajdonságai csak kismértékben térnek el a divalens antitestek ilyen tulajdonságaitól (Kontakte, 3/78., 10-17.). Ezeket FAB-fragmensekként jelölik [Biochem. J., 73., 119—126. (1959); Immunochem., 4., 369. (1967)]. Meglepődve tapasztaltuk, hogy ez a jelen esetben nem igaz, hanem azokból az antitestekből, amelyek a CK—MM-t teljesen és a CK—MB-t 55%-nál jobban, különösen 60-90%-kal gátolják, olyan monovalens fragmenseket (FAB-fragmenseket) kapunk, amelyek a CK-MM-t még mindig teljesen, azaz 99—100%-kal, a CK-MB-t azonban a hibahatáron belül csak 50%-kal gátolják. Ez lehetővé teszi, hogy alkalmas kísérleti állatokból, így juhokból házinyulakból és csirkékből kinyert antiszérumokat használjunk CK—MB meghatározására anélkül, hogy előzőleg költséges analitikai módszerekkel el kellene választani azokat az antiszérumokat, amelyek a CK-MB-t körülbelül 53%-nál jobban gátolják. Sokkal inkább lehetséges most már a szérumokat gátló tulajdonságaik előzetes meghatározása nélkül redukáló körülmények között proteolitikusan hasítani, majd a lehasított fragmensekkel a CK M alegységét, tekintet nélkül arra, hogy CK-MM izomenzimban vagy CK-MB hibridenzimben fordul-e elő, specifikusan kikapcsolni. A találmány keretein belül előnyösen olyan monovalens fragmenseket alkalmazunk, amelyeket olyan antitestekből állítottunk elő, amelyek CK-MB hidridenzimet több, mint 55%-kal, különösen előnyösen 60-90%-kal és a CK—MM izomtípusú izoenzimet teljesen gátolják. A találmány egy további előnyös kiviteli alakja szerint olyan monovalens fragmenseket alkalmazunk, amelyekből a maradék teljes antitesteket és a kristályosítható (Fc) fragmenseket elválasztottuk. Az elválasztást ismert módszerekkel, például gélkromatográfiával vagy só-oldattal szembeni dialízissel és cinkszulfáttal történő kicsapással [Immunochem., 14., 99. (1977)] végezhetjük. Az ismert módon előállított monovalens fragmensek, amelyeket - amint már említettük — előnyösen megtisztítunk az antitestektől és az Fc-fragmensektől, felhasználhatók a találmány szerinti eljáráshoz. Előnyösen azonban olyan monovalens fragmenseket alkalmazunk, amelyeknek SH-csoportjait előzőleg alkileztük. Erre a célra olyan alkilezőszerek alkalmasak, amelyek vizes közegben olyan 1 pH-értékeken hatékonyak, amelyek a proteinek tercier szerkezetét nem változtatják meg. Alkalmas alkilezőszer például a jódacetát és jódacetamid, előnyösen az utóbbit használjuk, mert az egyidejűleg a fragmensek előállására hasznát proteolitikus enzimeket inaktiváhatja. A találmány értelmében alkámazott FAB-fragmensek kinyeréséhez szükséges antiszérumok előállításakor a szokásos, az irodáomban sok helyen leírt immunizáló módszereket hasznájuk. Utáunk például a „Methods of Immunology and Immunochemistry” című munkára [4. kötet, a 313. oldától kezdődően, különösen a 336. oldal (1976)]. Az immunizálás során általában ügyelni kell arra, hogy lehetőleg tiszta antigéneket használjunk fel és elég hosszú ideig immunizáljunk. Az áltáános módszereket például az áábbi szakkönyvekben írják le: „Immunologische Arbeitsmethoden”, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1976.: 368-370. és „Microbiology”, Harper and Row, New York, 1970., 458—459. Az immunizáláshoz megfelelő, tiszta CK-MM izoenzimeket (antigéneket) az Archives of Biochemistry and Biophysics 150., 648-678. (1972) irodalmi helyen leírt módon nyerhetjük ki, az izolálás és tisztítás során a pufferhez stabilizálás céljából ditiotreitolt adunk. Az antiszérumokból a szokásos módon kivonjuk az IgG-frakciót, illetve a 7-globulint, majd redukáló körülmények között olyan proteolitikus enzimmel hasítjuk, amely a Hinge-tartományt (The Antibody Molecule, Academic Press New York, 1975, 169. és 174. old.) támadja meg. Példaképpen megnevezzük a papaint és pepszint. A hasítást például a The Antibody Molecule”, Academic Press, New York, 1975, 322-326. irodalmi helyen írják le. Redukáló körülmények biztosítására általában SH-csoportot tartalmazó vegyületeket adagolhatunk, például ciszteint, merkaptoetanólt és hasonlókat. A proteolitikus enzimmel végzett inkubálást leállíthatjuk, amikor a hasítás befejeződött, célszerűen ismert inaktiválószer beadagolásával. Amint a fentiekben már említettük, előnyös, ha jódacetamidot használunk. A FAB-fragmensek hasításkor keletkező szabad SH-csoportjait ezzel a leállításra használt szerrel alkilezzük. Az ily módon kezelt FAB-fragmensek nagyon jól használhatók a találmány keretein belül, különösen akkor, ha a maradék antitesteket és Fc-fragmenseket is eltávolítjuk. A CK-MB gátlása ezután precipitáció fellépése nélkül megy végbe, és gyakorlatilag pontosan 50%-os. A találmány keretein belül azonban olyan FAB-fragmenseket is alkalmazhatunk, amelyek nincsenek alkilezve vagy nincsenek megtisztítva a kísérőanyagoktól, ha ezáltal a meghatározás hibája kissé nagyobb is, még mindig a jól használható tartományba esik, azaz 50% ± 3%-kal gátolja a hibridenzimet. A B alegységnek a CK—MB hibridenzimben monovalens antitestek beadagolása után történő meghatározását a CK-meghatározás általánosan ismert módszereivel végezzük, ezek kreatinból vagy kreatinfoszfátból mint szubsztrátumból indulnak ki. Alkalmás eljárásokat írnak le például a „Methoden der enzymatischen Analyse” című szakkönyvben (Bergmeyer, H. U., Verlag Chemie, 1. kötet, 3. fejezet, 813-825. oldal). Különösen alkalmas nagy érzékeny-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
