181442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor-származékok előállítására
17 181442 18 A találmányunk szerinti eljárással előállítható tresztatinok és sóik a gyógyászatban a hatóanyagot és enterális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen iners hordozóanyagokat tartalmazó készítmények alakjában alkalmazhatók. Hordozóanyagként pl. vizet, zselatint, gumiarabikumot, laktózt, keményítőt, magnéziumsztearátot, talkumot, növényi olajokat és polialkilénglikolokat használhatunk. A gyógyászati készítmények szilárd (pl. tabletta, drazsé vagy kapszula) vagy folyékony (pl. oldat vagy szuszpenzió) alakban formulázhatók. A készítmények adagolási (dózis) egységenként 20— 50 mg hatóanyagot tartalmazhatnak. A napi dózis felnőtteknél 10—200 mg lehet és az egyéni adottságoknak és követelményeknek megfelelően változtatható. A tresztatinokat és sókat élelmiszerekbe és diétás készítményekbe (pl. cukor, gyümölcslé, csokoládé, lekvár, burgonyatermékek és kenyér) bedolgozva is felhasználhatjuk. A fenti élelmiszerek és készítmények célszerűen 0,1—1 súly% tresztatint tartalmazhatnak. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa I. Fermentáció Alábbi összetételű táptalajt készítünk: Burgonyakeményítő 20 g Glükóz 20 g Élesztőextrakt 5 g Nátriumklorid 2,5 g Ásványi só-oldat*1 1 ml Ionmentesített viz 1 liter *' Az oldat 1 liter ionmentesített vízre számítva 50 g cinkszulfát-heptahidrátot, 5 g kupriszulfát-pentahidrátot és 5 g mangáno-klorid-tetrahidrátot tartalmaz. A fenti oldat pH-ját 6 n nátriumhidroxid hozzáadásával 6-ra állítjuk be, majd 3,2 g kalciumkarbonátot és 20 g szójabablisztet adunk hozzá és a tápoldatot 20 percen át 120 C*on gőzzel sterilezzük. Streptomyces dimorphogenes sp. NR—320—OM7HB (FERM—P No. 3664) ferde-tenyészetének spóráit 10 db, 110—110 ml sterilezett táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmaycr-lombikba oltjuk át. A lombikokat forgó rázatógépre helyezzük és percenként 185-ős fordulatszám mellett 72 órán át 27C’-on rázatjuk. Az ily módon nyert tenyészetekkel oltjuk be az 50 literes fermentorokban levő 25 liter fenti összetételű táptalajt. A fermentációs ciklus 43 órán át tart, mialatt a hőmérsékletet 27 C°-on tartjuk és szűrt levegővel (25 liter/perc) levegőztetünk. Rázatási sebesség: 300 mozgatás/perc. Egy tipikus tresztatin-fermentlé (pH 6,9) aktivitása 3,1 x 104 IU/ml. II. Izolálás 1. Szénen örténő adszorpció A fentiek szerint ismertetett tresztatin-fermentációnál nyert teljes fermentlevet 5n nátriumhidroxid-oldattal pH 7,0 értékre állítjuk be, majd leszűijük. A szürlethez (19 liter, 3,1 x 104 IU/ml, 5,9 x 108 IU összesen) 380 g aktív szenet adunk és az elegyet 20 percen át szobahőmérsékleten keverjük, majd szüljük. A széntartalmú szűrőlepényt 4 liter csapvízzel mossuk és 10 liter forró 50%-os vizes acetonban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 6 n sósavval pH = 2 értékre savanyítjuk. 20 percen át 60 C°-on kevetjük, miközben 6n sósav időnkénti hozzáadásával pH = 2 értéken tartjuk. Az elegyet szüljük, a szürőlepényt további 10 liter 50%-os vizes acetonnal kezeljük a fenti módon. Az egyesített szűrleteket 6n nátriumhidroxid-oldattal pH = 7 értékre semlegesítjük, majd a kivált kevés csapadékot leszűijük. A szűrletet (5,6 x 108 IU összesen) vákuumban kb. 3 literre bepároljuk. A koncentrátum egy részét liofilizáljuk. Sötétbarna por alakjában nyers tresztatin-komplexet kapunk (3,2 x 106 IU/g), melyet a továbbiakban „I. lépésben nyert por”-nak nevezünk. 2. Dowex 50-en történő adszorpció A koncentrátumot (kb. 3 liter, 5,6 x 108 IU összesen) Dowex 50 oszlopon (H-forma, 3,5 liter, 20—50 szemcse méretű) visszük fel kb. 10 ml/perc sebességgel. Az oszlopot 10,5 liter ionmentesitett vízzel mossuk, 1 n ammóniával eluáljuk és frakciónál) uk. A3 * 101 IU/ml értéknél több tresztatint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk és liofilizáljuk. 75,4 g barna port kapunk (7,0 x 10® IU/ml, 5,3 x 108 IU összesen), melyet a továbbiakban „II. lépésben nyert por"-nak nevezünk. 3. Metanolos kezelés 75,4 g, a II. lépésben nyert port 3,770 ml metanolban szuszpendálunk és 2 órán át szobahőmérsékleten keverünk. Az oldhatatlan részt leszűrjük, kevés metanollal mossuk és szárítjuk. 41,5 g barna port kapunk (1,1 x 107 IU/g, 4,6 x 108 IU összesen), melyet a továbbiakban „III. lépésben nyert por”-nak nevezünk. 4. Dowex 1-en történő kromatografálás 41,5 g, a III. lépésben nyert port 100 ml ionmentesített vízben oldunk. Az oldatot Dowex 1-t (acetát-fonna, 2050 ml, 200—400 szemcseméretű) tartalmazó oszlopra (87 x 5,5 cm) visszük fel. Az oszlopot ionmentesített vízzel 2,5 ml/perc sebességgel eluáljuk és az eluátumot 17 ml-es frakciókban gyűjtjük össze. A 35—70 sz. aktív frakciót egyesítjük, vákuumban bepároljuk és liofilizáljuk. 22,6 g sárga port kapunk (1,8 x ]Q7 IU/g, 4,1 x 10* IU összesen), melyet a továbbiakban „IV. lépésben nyert por”-nak nevezünk. 5 Dowex 50-n történő kromatografálás 22,6 g, a íV. lépésben nyert port 50 ml ionmentesített vízben oldunk és az oldatot Dowex 50-t (ammónium-formí 2900 ml.,200—400 szemcseméret) tartalmazó oszlopra (85 x 6,6 cm) visszük fel. Az oszlopot 2,5 ml/perc sebességgel ionmentesített vízzel eluáljuk és az eluátumot 17 ml-es frakciókban gyűjtjük össze. A 65—89 sz. aktív frakciót egyesítjük, bepároljuk és liofilizáljuk. Világossárga por alakjában 10,6 g tresztatin-komplexet kapunk (3,6 x 107 IU/g, 3,8 x 108 IU összesen), melyet a továbbiakban „V, lépésben nyert por’’-nak nevezünk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
