181442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor-származékok előállítására
11 181442 12 pH-ját savval előnyösen 1—3 értékre állítjuk be és az eluálást 50—70 °C-on végezzük el. Az eluátumot betöményítjük és a koncentrátumot kationcserélőgyanta-oszlopra [pl. Dowex 50 (H-forma)] visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és 1 n vizes ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az amilázgátló aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és liofilizáljuk. A tresztatinokat tartalmazó poralakú nyersterméket a metanol-oldható szennyezések eltávolítása céljából metanollal kezeljük. A tresztatinok metanolban csaknem oldhatatlanok. A metanolban oldhatatlan, tresztatintartalmú maradékot vízben oldjuk. Az oldatot anioncserélőgyanta-oszlopra [pl. Dowex 1 (acetát-forma)] visszük fel. Az oszlop eluálását vízzel végezzük el és az eluátumot frakcionáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és kationcserélőgyanta-oszlopra [pl. Dowex 50 (ammónium-forma)J visszük fel. Az oszlopot vízzel eluáljuk. Az amilázgátló aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és liofilizáljuk. A kapott por nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás szerint főleg tresztatin A-, tresztatin B-t és tresztatin C-t tartalmaz. A fenti tresztatinok vizes oldatát kationcserélőgyanta-oszlopra [pl. Amberlit CG 50 (H- és ammónium-forma keveréke)] visszük fel. A H- és ammónium-forma aránya előnyösen 1 :9—9 :1 (térfogatrész). Az oszlopot vízzel eluáljuk, melynek során előbb a tresztatin B-t, majd a tresztatin-A-t, végül a tresztatin C-t kapjuk meg. Az ily módon nyert tresztatinokat ismét kromatografáljuk és így tiszta tresztatin A, tresztatin B, illetve tresztatin C komponenshez jutunk. A kapott tresztatinokat kívánt esetben különböző sóikká (pl. hidroklorid, szulfát, foszfát, acetát, oxalát stb.) alakíthatjuk. A tresztatin-hidrokloridok olvadáspontja a következő: Tresztatin A-hidroklorid 163—190 °C (habzás közben bomlik). Tresztatin B-hidroklorid 158—186 °C (habzás közben bomlik). Tresztatin C-hidroklorid 190—200 °C (habzás közben bomlik). A tresztatin-hidrokloridok fajlagos forgatóképessége a következő: Tresztatin A-hidroklorid [a]o = +162,5° (c=l,0, 0,01 n sósav) Tresztatin B-hidroklorid [ofe5 = +169° (c= 1,0, 0,01 n sósav) Tresztatin C-hidroklorid [a]o = +160,5° (c=l,0, 0,01 n sósav). Titrálás (vízben): pKa’ Ekvivalens Tresztatin A 5,0 720 Tresztatin B 5,0 960 Tresztatin C 5,0 650 A fenti adatok és a megadott molekulasúlyok azt mutatják, hogy a tresztatin A, tresztatin B és a tresztatin C két-, egy-, illetve háromértékű bázisok, összegképlet: Tresztatin A: C56Hg4N2O40 Tresztatin B: C37Hő3N028 Tresztatin C: C7jHi25N30J2 A szabad bázis alakjában levő tresztatin A, tresztatin B és tresztatin C magrezonancia spektrumát (D20-ban 100 MHz mellett) JEOL FX—100 spektrométerrel „homo gated decoupling” módszerrel (ő 4,71 ppm-nél végzett besugárzás) DSS belső standard felhasználásával határozzuk meg. A spektrumot a 4., 5. és 6. ábrán adjuk meg. Vékonyrétegkromatográfia: Lemez: szilikagél F254 (Merck) Oldószer-rendszer: kloroform—metanol—25%-os vizes ammónia—víz (1 : 4 : 2 : 1) Kimutatás: forró kénsav A fenti körülmények között a tresztatin A, B és C R értéke 0,19, 0,28, illetve 0,14. Nagynyomású folyadék-kromatográfia: Oszlop: p-Bondapack/CH (30,5 x 0,6 cm, Waters Co., USA) Oldószer: acetonitril—víz (63 : 37) Folyási sebesség: 4,0 ml/perc Kimutatás 210 nm-nél mért UV abszorpció. A fenti körülmények között a tresztatin A, tresztatin B és tresztatin C retenciós ideje 5,5,3,4, illetve 8,8 perc. A kromatogrammot a 7. ábra tartalmazza. Papírelektroforézis: Papír: Toyo Roshi No. 51 Puffer: hangyasav—ecetsav—víz (25 : 75 : 900; pH = 1,8) Feszültség: 3000 volt Idő: 40 perc A fenti körülmények között valamennyi tresztatin a katódhoz vándorol. Tresztatin A: 12 cm; tresztatin B: 9 cm; tresztatin C: 13 cm. Szerkezet: A tresztatin A, B és C 4n sósavval 80°C-on 3 órán át végzett hidrolízise glükózt és egy amint ad. Az amin pKa’ értéke 3,9 és összegképlete CI3H21N07 (a „high resolution” tömegspektrum alapján). A tresztatin A, B és C 5,4 illetve 6 mól glükózt tartalmaz. Enyhe savas hidrolízis (80 °C, 4 óra, H-formában levő Dowex 50 katalizátor alapján) trechalóz (a-D-glükopiranozil-a-D-glükopiranozid). A tresztatin A, B és C aminosavakat nem tartalmaz. A fenti adatokból és tulajdonságokból következik, hogy a találmányunk szerinti eljárással előállítható tresztatin A, B és C közös szerkezeti elemként trechalózt tartalmazó gyengén bázikus aminoglükozidok. A fenti adatok alapján a tresztatin A és B általunk javasolt szerkezete a 8. ábrának felel meg. A tresztatin A, B és C erős amilázgátló-aktivitást mutat és amilázgátló szerként alkalmazható. A hatást a leírás további részében igazoljuk. Az alábbi fermentációs úton előállított hagyományos amilázgátló szerek ismertek: 1. Nojirimycin, Niwa és tsai [Agr. Biol. Chem. 34, 966 (1970)]. A Nojirimycin monoszacharid és így egyértelműen különbözik a találmányunk szerinti eljárással előállítható tresztatinoktól. 2. Peptidcukor, Ueda S. és tsai: [Agr. Bioi. Chem. 37,2025 (1973) és Agr. Bioi. Chem. 40, 1167 (1976)]. A peptidcukor szerkezeti építőelemként aminosavakat tartalmaz. 3. Amilosztatin A, Murao S. és tsai: 123 891/1975. sz. nyilvánosságrahozott japán szabadalmi bejelentés (KOKAI). Az említett japán szabadalmi bejelentésben leírták, hogy az amilosztatin A-t 1—14 pH-tartományban erősen savas kationcserélőgyanták nem abszorbeálják. Ezzel szemben a tresztatin — mint már említettük — ilyen ioncserélőgyantákon adszorbeálódik. 4. Amiláz-inhibitor, Ueda K. és tsai: 54990/1976 sz. nyilvánosságrahozott japán szabadalmi bejelentés (KOKAI). A fenti amilázgátló szer molekulasúlya kb. 600, ami eltér a tresztatin A, B és C molekulasúlyától. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
