181434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív FR-900156 anyag előállítására
17 181434 18 frakciókat, és töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amíután 100 mg fehér színű porként FR—900156 vegyületet kapunk. 4. példa A 3. példában megadottak szerint előállított FR—900156 jelű vegyület fehér poralakját a fenti tisztítási eljárásokat megismételve tovább tisztítjuk, amiután még tisztább terméket vagy FR—900156 vegyületet kapunk. 5. példa 10 darab 500 ml térfogatú lombikba 100—100 ml alábbi összetételű táptalajt öntünk: Kukoricakeményítő 5% Rizsliszt 1% Szárított élesztő 1% Kukoricalekvár 1% A táptalajokat ismert módon sterilezzük, majd beoltjuk a Streptomyces violaceus ATCC 31481 mikroorganizmus ferdeagar tenyészetéről nyert spóráival. 30 C° hőmérsékleten 48 órán át rázógépen tenyésztünk. 301 össztérfogatú tankfermentorba 20 1 fenti összetételű táptalajt töltünk. Ismert módon sterilizáljuk a táptalajt, majd steril körülmények között beoltjuk a fenti módon előállított inokulummal. 30 órán át 30 C° hőmérsékleten fermentálunk. 4001 össztérfogatú fermentorba 320 1 6,5 pH-jú alábbi összetételű táptalajt töltünk: Oldható keményítő 2% Rizsliszt 1% Gyapotmagliszt 1% Nátrium-szulfát x 10 H20 2% A fenti módon előállított 20 1 inokulummal steril körülmények között beoltjuk a táptalajt. 72 órán át 30 C° hőmérsékleten tenyésztjük a mikroorganizmust. A tenyésztés közben percenként 170-et forduló keverőt működtetünk, és percenként 320 1 levegőt vezetünk át a táptalajon. A fermentáció befejezését követően 4 kg Radiolite szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd a micélium eltávolítására szűrjük. 3001 szűrletel 1501 aktivált szénből készült oszlopon kromatografálunk, az oszlopot 3001 vízzel mossuk. Az eluálást 600 1 50%-os vizes acetonnal végezzük, az eluátumot 120 1 térfogatra töményítjük. A sűrítményt 30 I előzőleg 6,0 pH-jú foszfát pufferral pufferolt DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. 30 1 vízzel, majd ezt követően 301 0,1M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 0,3M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. A 601 térfogatú eluátumot 301 aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 601 vízzel mossuk, a hatóanyagot 60 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Fagyasztva szárítjuk az eluátumot, amiután 120 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 41 vízben oldjuk, az oldatot FT -ciklusú CM-Sephadex gyantából készült 141 térfogatú oszlopon vezetjük át. Vízzel eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot töményítés után fagyasztva szárítjuk, így 20 g poralakú terméket kapunk. Ezt cellulózból készült oszlopra helyezzük. Az eluálást vizes propanoilal végezzük, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 5 g porhoz jutunk. Ezt 500 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,3 1 DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jű foszfátpufferral pufferoltuk. 0,1M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 0,2M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és 900 ml aktivált szénből készült oszlopra vezetjük. Vízzel mossuk az oszlopot, az eluálást 200 ml 50%-os vizes acetonnal végezzük. Töményítés után fagyasztva szárítjuk az eluátumot, ily módon 1 g poralakú termékhez jutunk. Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml H ^-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük. Az oszlopot vízzel eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, majd töinényítést követően fagyasztva szárítjuk, amiután 800 mg poralakú termékhez jutunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot kevés cellulózzal keverjük. A szuszpenziót cellulóz oszlopon kromatografáljuk. 100 ml acetonnal, majd ezt követően 300 ml n-butanol, ecetsav és víz 4:1:1 arányú elegyével mossuk az oszlopot, a hatóanyagot n-butanol, ecetsav és víz 4 : 1 : 2 arányú elegyének egy literével eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és fagyasztva szárítjuk, amiután 30 mg poralakú terméket kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást vízzel végezzük, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 5 mg FR—900156 jelű vegyületet kapunk. 6. példa Ismertetjük a gyógyszerészeti készítmények előállítását. a) Injekció előállítása A szükséges mennyiségű FR—900156 vegyületet ampullákba töltjük, oly módon, hogy mindegyikük 500 mg aktív hatóanyagot tartalmazzon. A baktériumok kizárására hermetikusan zárjuk az ampullákat. Használat előtt 2 ml steril desztillált vizet adagolunk, majd a vizes oldatot injekcióval juttatjuk a szervezetbe. b) Tabletták előállítása Az alábbi összetételű keveréket állítjuk elő: FR—900156 vegyület 200 mg Mannit 400 mg Keményítő 50 mg Magnézium-sztearát 10 mg A keverékből tablettákat készítünk. c) Kapszulák előállítása Az alábbi vegyületeket keverjük: FR—900156 vegyület 300 mg Magnézium-sztearát 15 mg A fenti keveréket ismert módon kemény zselatin kapszulákba töltjük. 7. példa 260 mg D-Lac-L-Ala-r-D-Glu(a-(OH)-(L)-mezoDAP-(L)-Gly-t 10 ml 0,1 N nátriumhidroxidban oldunk és az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 5 ml metanolban oldjuk és etanollal kicsapjuk. A szilárd anyagot kiszűrjük, etanollal mossuk és szárítva 270 mg megfelelő dinátrium-sót kapunk, op.: 224—228 °C. (bomlás közben). IR(nujol): 3270, 1650, 1605 cm -1. 8. példa 95 mg p-toluolszulfonsav-monohidrátot adunk 260 mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
