181413. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóztartalmú szacharid készítmény előállítására
11 131413 12 0,1 mólos 5,5 pH-jú cítrátpufferból és 0,2 ml 2%-os pullulanenzim oldatból (2. példa szerinti enzimkészítmény) áll. A végső szacharózkoncentráció 60%. A mintákat az alább megadott hőmérsékleteken tartjuk és mérjük 10 percig a „Technicon Autoanalyzer II”-n. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimes reakciósebesség 40 °C-on 1,89-szerese a 30 °C-on mértnek, 50 °C-on 1,29-szerese a 40 °C-on mértnek, és 60°C-on 1,48-szorosa az 50 °C-on mértnek. Ez a hőmérséklet emelkedésével növekvő reakciósebességet bizonyít. 5. példa A fruktozil-transzferáz enzim Michaelis—Menten állandójának (Km) meghatározása. Egy enzim Km értéke az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a termékképződés sebessége a V fele. A kővetkező eljárást használjuk a fruktozil-transzferáz enzim értékének megállapítására. 0,1 mólos citrátpufferral 5,5 pH-ra beállított 90%-os szacharóz törzsoldatból 9,8 ml térfogatú olyan oldatokat készítünk, amelyek 10 ml végtérfogatra feltöltve 5,10, 30,40, 50, 60 és 70% szacharózt tartalmaznak. A temperált mintákhoz 0,2 ml enzimoldatot adunk, amely 1,1 egység fruktoziltranszferáz enzimet tartalmaz. Utána a mintákat azonnal mérjük 55 °C-on a „Technicon Autoanalyzer II” segítségével az előbbiekben leírtak szerint. (Lásd fruktozil-transzferáz egység). Kontrollként (pg/ml-ben kalibrált) glükóz standard szolgál. Ezt követően pg/ml/perc-ben kifejezzük a glükózképződés sebességét különböző szubsztrátkoncentrációknál állandó mennyiségű (1,1 egységnyi) 1. példa szerinti fruktozil-transzferáz enzimkészítményt használva. szubsztrát pg/ml/perc pg/ml/perc 5 8,0 8,0 10 11,8 11,6 20 15,7 15,2 30 18,0 17,6 40 18,6 18,2 50 .19,2 17,2 60 17,8 18,2 70 15,6 — a) Másnap 60%-os szacharóz törzsoldattal megismételt mérések eredményei. A K 0,27 mólos szacharózkoncentráció. Maximális r6akm ciósebesség pH 5,5-nél és 55°C-on 1,374 mól szacharóz szubsztrátkoncentrációnál van. 6. példa A szacharózból képződő szekunder szubsztrát előállítása és izomerizálása. A) Szekunder szubsztrát előállítása. 600 g élelmiszer minőségű szacharózt oldunk vízben, és 800ml-re feltöltjük. Az oldat pH-ját híg sósavval 5,5-re állítjuk. Az 1. példa szerint előállított Celit hordozóra kötött száraz enzimkészítményből, amelynek aktivitása 550 egység/g, 11 g-ot szuszpendálunk 100 ml vízben. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman No. 1 szűrőpapíron átszívatjuk. A szűrőpogácsát további 100 ml vízzel mossuk. A 200 ml szűrletet utána hozzáadjuk a szacharóz oldathoz, amely egy csavaros kupakkal ellátott 0,5 gallonos (kb. 2,27 lit.) palackban van. A palackot utána 58 °C-os vízfürdőbe helyezzük, és 20 órán keresztül inkubáljuk, utána a reakciótermék mintáját nagy nyomású folyadékkromatográfiával szénhidrátösszetétel-meghatározásnak vetjük alá, és a következő eredményeket kapjuk: Szénhidrát-összetétel Fruktóz 2,4% Dextróz 32,8% dp2 10,6% dp3 22,9% DIV 31,3% A reakciótermék többi részéhez (azaz a szekunder szubsztráthoz) magnézium-kloridot adunk 5 millimólos koncentrációig, és a pH-t 8,4-re állítjuk híg nátrium-hidroxid oldattal. B) A szekunder szubsztrát folyamatos izomerizációja. Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 715-ből (lásd Re 29 152. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) származó glükóz izomerázt porózus alumínium-oxidra (például Coming Glass Co., Corning, New York által gyártott szabályozott pórusú hordozó, lásd 3 992 329. sz. amerikai szabadalmi leírás) kötünk a következők szerint: 1. A hordozót kétszer mossuk vízzel. 2. A hordozót 0,1 mólos nátrium-citrát oldattal 1 órán át kezeljük. 3. A nátrium-citrátot kimossuk a hordozóból, amíg a mosófolyadék vezetőképessége 1000 mikroohm. 4. A hordozót egy órán át 0,05 mólos magnézium-klorid oldattal kezeljük, majd a magnézium-klorid oldatot dekán táljuk. 5. Olyan térfogatú 0,05 mólos magnézium-klorid oldatot adunk hozzá, amennyi 400 egység/ml végső enzimkoncentráció beállításához szükséges. 6. Az izomeráz enzimkoncentrátumot 14 millió egység/ köbláb (körülbelül 500 egység/ml) mennyiségben hozzáadjuk a hordozóhoz. 7. A hordozót és az enzimet 22—24 órán át érintkezni hagyjuk, és utána a meg nem kötött enzimet desztillált vízzel kimossuk a hordozóból. Egy 3 cm x 18 cm méretű, csatlakozókkal ellátott üvegoszlopot, amely egy táptartályhoz csatlakozó szivattyúval van összekötve, megtöltünk az így készített kötött enzimmel. Az oszlop ágytérfogata töltés után 45 ml. Az oszlop az izomerizáció során 60 °C-on üzemel. A töltött oszlopon először 5 millimól magnézium-kloridot tartalmazó és pH 8,4-re állított 50 súly%-os dextrózoldatot nyomatunk át, hogy megbizonyosodjunk róla, hogy működik-e az oszlop. Az oszlop átfolyási sebességét 292 ml/óra értékre állítjuk be. Az oszlopot utána a töltet szintjéig leengedjük. A szekunder szubsztrát bevezetését manuálisan végezzük, amíg 20 ml elfolyó összegyűlik, utána a szekunder szubsztrát átfolyási sebességét 292 ml/óra értékre állítjuk be. Az összegyűlt első 100 ml szirupot eldobjuk, hogy hagyjuk kicserélődni a szubsztrátot. A maradék (850 ml) szubsztrátot utána átnyomatjuk az oszlopon. Egy óra múlva az átfolyási sebesség 570 ml/óra értékre nő. Az átfolyási sebességet visszaállítjuk, és az körülbelül 300 ml/óra értékre nő az átnyomatás végére. A szekunder szubsztrát átnyomatásának befejezése után az oszlopot visszakapcsoljuk- dextrózra, hogy ellenőrizzük, megmaradt-e az izomeráz-aktivitás. Az alábbi táblázat tartalmazza a kiindulási szekunder szubsztrát és az izomerizációs oszlopról kapott végtermék nagynyomású folyadékkromatográfiás analízise eredményeinek összehasonlítását: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
