181177. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutaminsavat és L-aszparaginsavat tartalmazó, szinergetikus hatású készítmények előállítására
7 i8in7 8 Egy következő kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogyan hasznosítják az izolált máj-mitokondriumok az inkubációs közeghez adagolt szervetlen foszfátokat, és a szervetlen foszfátok hasznosítása milyen mértékű oxigénfogyasztással jár együtt. 2—4 mg izolált patkánymáj-mitokondrium-fehérjét adtunk a következő összetételű, 3,0 ml térfogatú, 7,4-es pH-értékű inkubációs közeghez: 125,0 mmól KC1, 25,0 mmól Trisz-HCl, 8,0 mmól MgCl2, 1,0 mmól ATP • Na2, 4,8 mmól glükóz, 1,0 mmól almasav, 50 NE hexokináz, 30,0 mmól szervetlen foszfát. Ezután a rendszerhez hozzáadtuk a vizsgálandó hatóanyagot, illetve hatóanyag-keveréket, és a rendszert 15 percig 30 °C-on inkubáltuk. A szervetlen foszfát-tartalmat Pinchot módszerével [J. Bioi. Chem. 205, 65 (1953)], a P/0 hányadost (a sejtek által felhasznált szervetlen foszfor mennyiségének és a felhasználás alatt fogyott oxigén mennyiségének hányadosa) pedig Slater és munkatársai módszerével [Methods in Enzymology X. kötet; szerk.: Estabrook; kiadó: Acad. Press, New York and London (1967)] határoztuk meg. A következő hatóanyagokat, illetve hatóanyag-keverékeket vizsgáltuk: a) L-aszparaginsav K-só 3 mmól b) L-gJutaminsav K-só 3 mmól c) l-aszparaginsav K-só + L-glutaminsav K-só (1 : 1) 1,5 + 1,5 mmól d) L-aszparaginsav K-só + L-glutaminsav K-só (2:1) 2 + 1 mmól e) L-aszparaginsav K-só + L-glutaminsav K-só (1:2) 1+2 mmól Az észlelt eredményeket a II. táblázatban közöljük. II. táblázat Hatóanyag P/O a) 1,82 ±0,08 b) 3,07 ± 0,04 c) 3,34 ± 0,03 d) 4,59 ± 0,07 e) 5,79 ± 0,04 A II. táblázat adataiból megállapítható, hogy az L-aszparaginsav és L-glutaminsav káliumsóinak 1:1 mólarányú elegyét beadagolva alig érünk el kedvezőbb eredményeket, mintha az L-glutaminsav-káliumsót önmagában alkalmaznánk. Ezzel szemben ha az L-aszparaginsav-káliumsót és az L-ghitaminsav-káliumsót 1 :2, illetve 2 :1 mólarányú elegy formájában alkalmazzuk, a P/O hányados a legnagyobb hatású egyedi komponens (L-glutaminsav-káliumsó) beadagolásakor elérhető érték másfél-kétszeresére nő, ami azt jelenti, hogy az élő szervezet azonos menynyiségű szervetlen foszfát hasznosításához 40-50%-kal kevesebb oxigént igényel. Az I. és II. táblázat adataiból tehát megállapítható, hogy az L-aszparaginsav és az L-glutaminsav 1 : 2, illetve 2 :1 mólarányú elegyei lényegesen kedvezőbben befolyásolják az élő szervezet energiaháztartását és lényegesen nagyobb mértékben csökkentik az élő szervezet energiaigényét, mint az eddig ismert, legkedvezőbb hatású 1 :1 mólarányú keverék. 2. Izolált agymitokondriumok működésére gyakorolt hatás vizsgálata: Ismert, hogy etanol hatására jelentősen csökken az agyi synaptosomák ATP-az-aktivitása és acetilkolinészteráz-aktivitása [Sun és Samorajski: J. Neurochemistry 17, 1365 (1970)]. A következő kísérletsorozatokban azt vizsgáltuk, hogy az etanol ezen káros hatása milyen mértékben szorítható vissza Lraszparaginsav, L-glutaminsav, illetve keverékeik alkalmazásával. Három 250-300 g testsúlyú, előzetesen nem éheztetett hím albínó patkányt dekapitálással leöltünk, majd a patkányagyakból Sun és Samorajski módszerével [J. Neurochemistry 17, 1365 (1970)] elkülönítettük a mitokondriális synaptosomákat. Az ATPaz-aktivitást Sun és Samorajski módszerével [J. Neurochemistry 17, 1365 (1970)] határoztuk meg, és (imól fogyott P/mg fehérje/10 perc egységekben fejeztük ki Az alapértékek meghatározásához a következő összetételű inkubációs közegeket alkalmaztuk: a) Mgí+ ATPaz-aktivitás: 50,0 mmól Trisz-HCl (pH = 7,4), 5,0 mmól Trisz-ATP, 5,0 mmól MgCl2; b) K+-Na+ ATPaz-aktivitás: a fenti összetételű közeg 100,0 mmól NaCl-dal és 20,0 mmól KCl-dal kiegészítve. Az etanollal befolyásolt állapotban jelentkező ATPaz aktivitás meghatározása során a fenti összetételű közegekhez 2,5 térfogat% etanolt is adtunk. Az aminosavakkal elérhető védőhatás vizsgálata során az etanolt is tartalmazó inkubációs közegekhez a következő hatóanyagokat, illetve hatóanyagkeverékeket adtuk: a) L-glutaminsav Trisz-só 30 mmól b) L-aszparaginsav Trisz-só 30 mmól c) L-glutaminsav Trisz-só ♦ L-aszparaginsav Trisz-só 15 + 15 mmól d) L-glutaminsav Trisz-só + L-aszparaginsav Trisz-só 10 + 20 mmól e) L-glutaminsav Trisz-só + L-aszparaginsav Trisz-só 20 + 10 mmól Az észlelt eredményeket a III. táblázatban közöljük. Az acetilkolin-észteráz aktivitást (AChE aktivitás) Ellman és munkatársai módszerével [Biochem. Pharmacol. 7, 88 (1961)] határoztuk meg. Az alapérték meghatározása során az inkubációs közeghez sem etanolt, sem hatóanyagot nem adtunk, az etanollal befolyásolt állapotban mért aktivitást 2,5 térfogat% 5 10 15 20 2'5 30 35 40 45 50 55 60 65 4
