181104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 41200 RP jelű, immunitást fokozó anyag előállítására
9 181104 10 1. példa A) A sejtek előállítása 170 literes fermentáló kádba 1200 g peptont, 600 g húskivonatot, 1200 ml szójababolajat adunk be és vezetéki vízzel 110 literre töltjük fel. j A keverék pH-ját 10 n nátriumhidroxid-oldatta' 6,90-re állítjuk be és 40 percig 122°-os gőz átbubo rékoltatásával sterilizáljuk. A sterilizálás folyamár lecsapódott gőz miatt a lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 120 literre növekszik, és pH-ja 6,70. Ezután Micrococcus sedogenes M 78 törzs Erlenmeyer-lombikba keveréssel kapott 200 ml tenyészetével beoltjuk. A tenyésztést keverés és steril levegővel való levegőztetés közben 27°-on 14 óra hosszat inkubálva hajtjuk végre, ekkor a tenyészet alkalmas a termelő tenyésztés beoltására. A termelő tenyésztést 800 literes fermentáló kádban hajtjuk végre, ebbe az edénybe anyagokat visszük be: a következő Lteljsav 4 kg, szójaolaj 2 liter, ammóniumszulfát 2,4 kg, nátriumklorid 2 kg, monokáliumfoszfát 0,4 kg, magnéziumszulfát, 7H2 O 0,8 kg, rézszulfát, 5H20 0,02 kg, cinkszulfát, 7H20 0,012 kg, kobaltklorid, 6H20 0,008 kg, vezetéki vízzel kiegészítve 370 literre. A közeg pH-ját 2950 ml, 10 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 7,10-re állítjuk be, majd 40 percig 122°-os gőzt buborékoltatunk át rajta. A sterilizálás folyamán lecsapódott gőz miatt a lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 400 liter, pH-ja 4,20, ezt 2100 ml, 5 n vizes nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 6,60-ra módosítjuk. Ezután ezt a táptalajt 170 literes fermentáló-kádban levő, fent leírt összetételű oltóanyag 40 literével beoltjuk és percenként 205 fordulatú turbinával 16 óra hosszat keverve és óránként 15 m3 steril levegővel levegőztetve, 27°-on 16 óra hosszat inkubáljuk. A művelet végén a tenyészet pH-ja 8,20 és térfogata 440 liter. Az így kapott tenyészetet +4°-ra hűtjük le, és pH-ját 4 liter 5 n sósav hozzáadásával 3-ra állítjuk be. A sejteket percenként 4000 fordulattal (2900 g) centrifugáljuk. A sejteket 80 liter —10°-on hűtött etanolban felvesszük, 15 percig keverjük, centrifugálással elválasztjuk, és 15 óra hosszat 5 Torr nyomáson 35°-on szárítjuk. Ily módon 1500 g száraz sejtet kapunk. B) A 32919 RPjelű anyag előállítása Kettős falú köpenyében víz keringetésével állandó hőmérsékleten tartott és erőteljes keverőképességű központi keverővei ellátott, rozsdamentes acél reaktorban levő 40 liter, steril, desztillált vízben az A) szakasz szerint előállított 1 kg sejtet szuszpendáljuk. A szuszpenzió pH-ját, 10 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 7,0-ra állítjuk be. Ezután 2 g lizozimet adunk hozzá, 2 óra hosszat 37°-on keverjük és közben a pH-t időnként 5 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával 7,0-re visszaállítjuk. A keveréket ekkor Sharpies Ml 6 centrifugán centrifugáljuk (óránként 30 liter teljesítménnyel egymás után 2 menetet percenként 17 000 fordulattal végezve). A 37 liter felülúszó folyadékot IRIS 3042 akrilát membránnal ellátott UPF készüléken ultraszűrjük, a maradékot visszacirkuláltatva és háromszor 40 liter ionmentesített, +4°-on hűtött vizet adva hozzá ultraszűijük. Ily módon 7 liter koncentrált és a kis, körülbelül 25 000 daltonnál kisebb molekulasúlyú molekuláktól mentesített maradékot kapunk, pH-ját 5 n nátriumhidroxid-oldattal 7-re visszaállítjuk, majd a kapott oldatot Iiofílizáljuk. így 147 g nyers terméket kapunk. Ennek a terméknek 31 g-ját 1550 ml, 20° körüli hőmérsékletű, ionmentesített vízben 30 percig tartó keverés közben feloldjuk, és a keverést tovább folytatva, 5 perc alatt hozzáadunk literenként 668 g kalciumklorid-dihidrátot tartalmazó 31 ml vizes oldatot, majd a keverést 30 percig tovább folytatjuk. A keletkezett csapadékot percenként 40 000 fordulatú, óránként 5 liter teljesítményű, laboratóriumi Sharpies gépen centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó folyadékot 3 napig +4°-on cellulóz membránon 40 liter ionmentesített vízzel szemben dializáljuk. A maradékot ezután lombikban 310 ml nátrium alakban lévő Dowex 50 X2 polisztirol-szulfonsav gyantával 1 óra hosszat, keverés közben kezeljük. A gyantát szűréssel elválasztjuk és a szűrőn 310 ml vízzel mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot egyesítve liofilizáljuk. Ily módon só alakjában 17 g 32919 RP-t kapunk. Jellemzői a következők: kinézése fehér por; összetétele: víztartalom (Fischer módszerrel meghatározva) = 15,7%, szárazanyagra számítva: proteinek (ossz. aminosav) = 24,6% poliszacharidok = 3,9%, nukleinsavak = 28,9% (ultraibolya spektrum alapján). Elemi összetétel: C = 46,30%, H = 5,84%, O (különbségből számítva) = = 30,71%, N = 10,04%, P = 3,11%, S = 0,5%-nál kisebb; Na = 3,70%, Ca = 0,30%. C) A 31919 RP jelű anyag tisztítása Az 1. példa B) szakaszában leírt körülmények között kapott 25 g 32919 RPjelű anyagot keverővei és hőmérsékletszabályozóval ellátott, 2 literes reaktorban lévő 1 liter ionmentesített vízben feloldjuk, majd hozzáadunk 1 liter fenol-víz elegyet (1 kg 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 x
