181031. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergozin előállítására
5 181031 6 nagyon kis töredék darabokra esik szét (még folyékony M 10 közegben is). Zsírcseppecskéket relatíve kis számban csak a 846 és a 829 számú közegen tudtunk megfigyelni. A szubmersz kultúrák micéliuma (mintegy 14 napos termelő közeg) hosszú, elágazó, mintegy 5 ju vastagságú hifákból áll. A hifaknak részben gömb formájú, lekerekített duzzanataik vannak, és sok zsírcseppecskét tartalmaznak. Konídiumokat nem fi- 10 gyeltünk meg. Makroszkopikus kinézet: A makroszkopikus kinézetet olyan kultúrákon határoztuk meg, amelyek 24 ± 1 °C-os hőmérsékleten, 14-16 nap alatt agar-csészén (átmérő 10 cm) nőttek. A közegek összetételét az 1. táblázatból lehet kiolvasni. M10 közeg: nagyon jó növekedés redőzött, részben felemelkedő felülettel, barna pigmentálódás, a hátoldal részben sötét foltokkal, nincsenek konídiumok. 846 közeg: jó növekedés, redőzött, pacalszerű felületű telepek, barna, a hátoldal világosbarna, nincsenek konídiumok. 829 közeg: jó növekedés. A világosbarnától barnáig terjedő színű telepeknek redőzött, ráncos felületük és szabálytalan szélük van. A hátoldal világosbarna. 784 közeg: jó növekedés. A telepek felső oldala barna, alsó oldala színtelen. Redőzöttek, ráncosak és szabálytalan szélük van. Nincsenek komdiumok. 1. példa A MUT 168 törzset tartalmazó ferde csövecskékből kiindulva, a micélium mozsárban történő felaprításával 500 ml-es rázólombikban levő 100 ml 821 jelű táptalajt oltunk be, és így előkultúrát képezünk. A 821 jelű táptalaj összetétele a következő: szacharóz 200 g, ammónium-citrát 15 g, Ca(N03)2 1 gkh2po4 0,25 g, MgS04 • 7H20 0,3 g, FeS04 ■ 7H20 10 mg, ZnS04 • 7H20 30,8 mg, KG 0,1 g, élesztő kivonat 3,0 g, víz 1000 g-ig. pH (a sterilizálás előtt): 5,8-6,0 Sterilizálás: 30 percig 110 °C-on. A lombikokat 7 napig 24 ± 1 °C hőmérsékleten 200/perc sebességgel rázatjuk. A kapott kultúrák 10%-át arra használjuk fel, hogy beoltsunk vele 100 ml 720 jelű táptalajt tartalmazó 500 ml-es lombikokat. A 720 jelű táptalaj összetétele a következő: szacharóz 200 g, ammónium-citrát 15 g, Ca(N03)2 1 g, kh:po4 0,25 g, MgS04 • 7HjO 0,3 g, FeS04 ■ 7H20 10 mg, ZnS04 • 7H20 30,8 mg, KC1 0,1 g, víz 1000 g-ig. pH (sterilizálás előtt): 5,8-6,0 Sterilizálás: 30 perc 110 °C-on. A gomba termelés céljából történő tenyésztését 40 célszerűen folyékony tápközegekben felületi és/vagy szubmersz kultúrában végezzük. A tápközegek asszimilálható szénforrást, mint amilyen például a szacharóz, a glükóz, a mannit, a szorbit, a glicerin és a citrom- vagy a borostyánkősav, asszimilálható nitro- 4* génforrást, mint amilyen például az ammónia, az aszparagin, a pepton, a kazein hidrolizátum vagy egy ammónium-só, valamint ásványi sókat tartalmaznak. A fermentálás történhet például Fembach-, Erlenmeyer- vagy rázólombikban, vagy fermentorban. Az 50 alkaloidok legnagyobb részét Ç>80%) a tápközeg tartalmazza, és szokásos módon kinyerhetjük. A kultiváció célszerűen 1-3 fokozatban történik. Előnyös, ha az előkultúra 5—12 napos és ha az ol- 55 tási arány (előkultúra/főkultúra) 1 :5-től 1 :20-ig terjed. A pH-érték 4,0 és 6,2, a hőmérséklet 20 °C és 30 °C között lehet. A törzs fenntartása történhet csövecskékben vagy védőkolloidok, mint például 60%-os szacharóz-oldat és sovány tej 2:1 arányú 60 elegye, alkalmazása mellett végzett mélyhűtéses tárolással. A találmányunk további részleteit a kiviteli példák szemléltetik. 65 Az előkultúrákra megadott körülmények között végzett 12-21 napos tenyésztés után a kultúrák 180 -280 pg/ml-es össz-alkaloid-tartalommal rendelkeznek, amely 90%-ban ergozin-ergozinin keverékből és 10%-ban klavin alkaloid keverékből áll. Az alkaloidokat önmagában ismert eljárások szerint izolálhatjuk és tisztíthatjuk. 2. példa Az 1. példában leírt előkultúra 10%-át 100 ml 720 jelű táptalajt tartalmazó 400 ml-es Fernbach-lombikba visszük át. A tenyésztést 24 ± 1 °C-on végezzük, és 20 nap kultuváció után a felületi micélium ot leválasztjuk a táptalajból. A lombikok 250-350 (i% össz-alkaloidot tartalmaznak a táptalaj 1 ml-jére számítva. Az alkaloid keverék összetétele megegyezik az 1. táblázatban leírttal. Az alkaloidok azonosítása a következőkben leírt módon történt: A felületi kultúrák 20 napos fermentációjuk után 300 Mg/ml alkaloid-tartalommal rendelkeznek. A fermentációs lé 10 ml-ét meglúgosítjuk és kloroformmal kimerítően extraháljuk. Az extraktumot 3
