180816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadást elősegítő készítmény előállítására emberi vérplazmából
3 180816 4 aktivált protrombin-komplex-készítményeknek VlII-faktor-inhibiíort tartalmazó vérű betegek vérzés esetén történt sikeres alkalmazásáról számolnak be. Az ilyen protrombin-komplex-koncentrátumok úgynevezett aktiválása valószínűleg ismeretlen szennyezések jelenlétére vezethető vissza. Az ilyen készítményeket ugyanis nem lehetett tényleges hatóanyagukra vonatkozólag megvizsgálni és standardizálni. Az eredmények bizonytalanok és kétségesen reprodukálhatók. A jelen találmány célkitűzése az volt, hogy a fentiekben ismertetett nehézségeket és hátrányokat kiküszöböljük és olyan készítményt állítsunk elő, amely ismételhetően és célzott módon alkalmazható a kívánt célra, a VlII-faktor-inhibitor hatásának megkerülésére. A VlII-faktor-inhibitort megkerülő aktivitás megfelelő vizsgálati módszerrel mérhető és standardizálható kell, hogy legyen. A készítménynek klinikaiig hatékonynak és a páciensek által elviselhetőnek kell lennie, vagyis a VlII-faktor-inhibitort tartalmazó vérű páciensek vérzése esetén hatékonyan kell véralvadást előidéznie és nem szabad káros mellékhatásokat mutatnia. Ezt a feladatot a találmány értelmében oly módon oldjuk meg, hogy citrát-iont és a protrombin-komplexet tartalmazó emberi vérplazmát 5,5—8,5 pH-értéken, 0—30 C° hőmérsékleten szabad kalcium-ionok távollétében a vérplazma mennyiségére számított 0,05—5% mennyiségben kovasavvagy szilikáttartalmú, a véralvadásra fiziológiai úton ható felületaktív anyagokkal, előnyösen szilikagéllel vagy kaolinnal kezelünk, ezt követően a vízben oldhatatlan anyagokat centrifugálással elválasztjuk és a szupernatáns folyadékot önmagában ismert módon, bázisos, előnyösen dietilaminoetil-csoportot tartalmazó nagymolekulájú anyaggal kezeljük, az ioncserélőt ezt követően sóoldattal mossuk, majd az új VlII-faktor-inhibitor-áthidaló-aktivitású véralvadás-előidéző anyagot és a II-, VII-, IX-, X-faktorokat sóoldattal eluáljuk, az eluátumot dializáljuk, majd liofilizálással koncentráljuk. Az új, „FEIBA” véralvadás-előidéző anyag fehérje-jellegű, a nem aktivált II-, VII-, IX- és X-faktoroknál (protrombin-komplex) nagyobb molekulasúlyú. Míg az említett faktorok molekulasúlya 70 000 körül van, addig az új hatóanyag molekulasúlya körülbelül 100 000. Az új készítmény előállítására kiindulási anyagként citrátos emberi vérplazmát alkalmazunk, amely az összes véralvadási faktorokat natív alakban tartalmazza; alkalmazhatók továbbá oly vérplazma-frakciók is, amelyek a VIII- faktor (AHF) elkülönítése után visszamaradnak, mint például a Kryo-precipitatum vagy a Cohn-féle I precipitatum leválasztása után kapott vérplazma-szupernatáns (3 803 115 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A találmány szerinti eljárás során a kovasav- vagy szilikáttartalmú, a véralvadásra fiziológiai úton ható felületaktív anyagokat a vérplazma mennyiségére számítva 0,05—5%, előnyösen 0,1—1% mennyiségi arányban alkalmazzuk. A vérplazma ily módon történő kezelésére célszerűen olyan anyagokat alkalmazunk, amelyek legnagyobbrészt finom eloszlású szilíciumdioxidból állnak, mint például a diatomaföld-típusú anyagok, például a celit, továbbá szilíciumdioxidból és alumíniumdioxidból álló anyagok, például kaolin. Általában olyan anyagok alkalmasak erre a célra, amelyeket a véralvadási rendszerben „felületaktív” anyagokként ismerünk, illetőleg amelyek felületaktív tulajdonságuk folytán képesek a véralvadás kontakt-fázisának a megindítására. Míg az ilyen anyagok felületaktív hatása folytán aktiválható véralvadási faktorok (XI- és XII-faktor) aktivált alakjukban adszorbeálódnak az említett felületaktív anyagokon, addig a II-, VII-, IX-, és X-faktor a keletkezett FEIBA véralvadást előidéző anyaggal együtt a szupernatáns folyadékban marad és a felületaktív anyag eltávolítása után, ismert módszerek alkalmazásával elkülöníthető vagy dúsítható. Erre a célra például gyengén bázisos ioncserélők alkalmazhatók; különösen jól beváltak a dietil-aminoetil(DEAE)-csoportot tartalmazó nagymolekulájú anyagok, például a cellulózhoz kötött DEAE vagy a térhálósított dextrán. Az ioncserélőn adszorbeált, fokozott ionerősségű plazma-fehérjék mosás és eluálás útján történő eltávolítása után a tisztított és dúsított FEIBA anyagot tartalmazó fehérje-frakció izolálható. A sók dialízissel történő eltávolítása és ezt követő líofilizálás útján száraz, stabil alakban különíthetjük el a FEIBA anyagot tartalmazó nyers frakciót. Ebből a nyers készítményből azután vízben való újbóli oldás, sók hozzáadása, pH-beállítás, steril szűrés és újbóli liofilizálás útján juthatunk a már felhasználásra kész készítményhez. A találmány szerinti eljárással előállítható készítmény tulajdonságainak vizsgálata során kitűnt, hogy a IIA-faktor (trombin) és a Xa-faktor semmivel sem járul hozzá a FEIBA anyag aktivitáshoz. A találmány szerinti eljárással előállított készítményben esetleg nyomokban jelenlevő trombin semmivel sem rövidíti meg a VlII-faktor-inhibitor-plazma részleges tromboplasztin-idejét. A Xa-faktor-aktivitás inhibitoraként ismert szójabab-tripszin-inhibitor sem gátolja a találmány szerinti eljárással előállított készítmény FEIBA-anyag aktivitását. Gél-kromatográfiai vizsgálatokkal is kitűnt, hogy a találmány szerinti eljárással előállítható új anyag molekulasúlya nagyobb, mint a protrombin-komplex ismert faktorainak, a II-, VII-, IX- és X-faktornak a molekulasúlya. Minthogy továbbá a protrombin-komplex aktivált faktorai a megfelelő natív (nem aktivált) véralvadás-faktor egy töredékének enzimes lehasítása útján keletkeznek és így kisebb molekulákból állnak, mint a megfelelő nem aktivált faktor molekulája, bizonyossággal feltehető, hogy a találmány szerinti eljárással előállított készítményben a VlII-faktor-inhibitor-áthidaló aktivitást nem a protrombin-komplex valamely aktivált faktora okozza, hanem egy újonnan létrejött, nagyobb molekulasúlyú anyagnak tulajdonítandó ez a hatás. Az ily módon képezett új anyag jellemzésére egyrészről a II-, VII-, IX- és X-véralvadás-faktorok aktivitásának a FEIBA anyag aktivitáshoz való viszonyát vehetjük alapul: ez a viszony egységekben kifejezve 0,1 és 10 között, különösen 0,5 és 2 között lehet. Egy II-VII-IX-X-faktor-egység e faktorok oly aktivitásának felel meg, amely átlagosan 1 ml friss citrátos emberi vérplazmában van jelen; egy FEIBA- egységnek azt a FEIBA anyag aktivitást tekintjük, amely egy nagytiterű VlII-faktor-inhibitor-plazma aktivált parciális tromboplasztin-idejét a vak-érték felére csökkenti. Az új hatóanyag jellemzésére másrészről felhasználhatjuk ennek az anyagnak az amidolitikus aktivitását is. Amidolitikus aktivitáson valamely anyagnak azt a képességét értjük, hogy oly standardizált peptid-vegyületekben, amelyek egy amidkötésen keresztül kapcsolódnak a p-nitro-anilin kromofórhoz, p-nitro-anilint hasítanak le, amely azután fotometriásan meghatározható. Ilyen standardizált peptid-készítményeket például a svédországi KABI cég állít elő; így az S —2160 peptid (N-benzoil-L-fenil-alanil-L-valil-L-arginin-p-nitro-anilid-hidroklorid) trombinra specifikus, az S—2222 készítmény (N-benzoil-L-izoieucil-L-glutamil-L-glicil-L-arginil-p-nitro-anilid-hidroklorid) Xa-faktorra és az S— 2251 készítmény (D-valil-L-leucil-L-Iizil-p-nitro-aniliddihidroklorid) plazminra specifikus. Ha a találmány szerinti eljárással előállított készítményt az említett szubsztrátumokkal szemben vizsgáljuk, akkor csak elhanyagolhatóan cse5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
