180787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztein-tartalmú peptidek előállítására
11 180787 12 b2) Ddz-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH • 1 H20 69,8 g (120 millimól) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH ■ 1 H20 [Chem. Bér., 103. 2034—2040 (1970)] és 16,2 g (120 millimól) HOBt 300 ml dimetil-formamidos oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 63,95 g (120 millimól) Ddz-Ile- OTcp-t és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük. Ezután, ha még maradt tripeptid, ismét hozzáadunk 5,33 g (10 millimól) Ddz-Ile-OTcp-t. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten éjszakán át állni hagyjuk, majd lepároljuk az oldószert. A visszamaradó olajat 400 ml etil-acetát és 250 ml telitett nátrium-karbonát-oldat közötti megosztásnak vetjük alá, amikor is a Ddz-tetrapeptid nátriumsója az etil-acetát-fázisba'jut. Az etil-acetát-fázist lehűtjük és egymás után a következő oldatokkal rázzuk ki: mintegy 120 ml In citromsav-oldattal (a kirázás után a vizes fázis pH-ja célszerűen mintegy 3—4), 150 ml pH = 3-as citrát-puffer-oldattal, és kétszer 200—200 ml vízzel. Az etil-acetát-fázist ezután vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot eldörzsöljük petroléterrel és leszívatjuk. Kitermelés: 99,8 g (90%). Op: (130) 135—140 C° (bomlás közben). [a]p = — 34,1° (c=l, metanolban). Elem-analízis a C4S,H<S2N4O]0S-1 H20 összegképlet alapján (molekulasúly: 917,1): számított: C = 62,93%; H = 7,l 1%; N = 6,02%; S = 3,42%; talált: C = 63,0%; H = 6,8%; N = 5,8%; S = 3,4%. b2) H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH 2,7 g (2,94 millimól) Ddz-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH-t feloldunk 52 ml 5%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsavban, mely 1% vizet tartalmaz, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük. Ezután 3 ml piridinnel semlegesítjük és az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot eldörzsöljük vízzel, leszívatjuk, vízzel mossuk és foszforpentoxid fölött szárítjuk. A terméket további tisztítás céljából kétszer kiforraljuk 30—30 ml etil-acetáttal és forrón leszívatjuk. Kitermelés: 1,51 g (70%). [aß2 = +3,7° (c — 1, 90%-os ecetsavban). Elem-analízis a C37H48N4OeS ■ 0,3 CF3COOH • 1,5 H20 összegképlet alapján (molekulasúly: 738,1): számított: C = 61,18%; H = 7,00%; N = 7,59; CF3COOH = 4,63%; talált: C = 61,0%; H = 7,0%; N = 7,7%; CF3COOH = 4,7%. 6. példa a) H-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 3,429 g (1,5 millimól) H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu')-Gln-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Bu')-Cys(Trt)-Asn-OBu‘-trifluor-acetátot feloldunk 19 ml etil-merkaptán és 19 ml trifluor-ecetsav elegyében. Az oldatot szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, majd keverés közben beleöntjük 250 ml vízbe. A csapadékot leszívatjuk, éterrel mossuk és szárítjuk. Majd eldörzsöljük éterrel, leszívatjuk és szárítjuk. Kitermelés: 1,964 g. Ezt az anyagot újbóli hasításnak vetjük alá. Kitermelés: 1,6 g (61%). A szürletekből éteres extrakció és liofilizálás segítségével még összesen 300 mg cím szerinti termék nyerhető. Összkitermelés: 1,93 g (73%). Elem-analízis a C63H95N15O21Si2CF3COOHT0 H20 öszszegképlet alapján (molekulasúly: 1756,9): számított: C = 44,43%; H = 6,65%; N = 11,96%; S = 3,65%; talált: C = 44,1 %; H = 6,0%; N = 11,6%; S = 4,3%. AzNMR-spektrum nem tartalmaz Bu'-jeleket és tritil-jelet is csak nyomokban (mintegy 5%-ban mutatható ki). Az izoleucinból és a két leucinból eredő 18 proton metil-jelei (5 = 0,7—1,0 ppm) és a tirozinok 8 aromás protonjainak jelei (5 = 6,5—7,1 ppm) helyes arányban vannak. b) A H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu')-GIn-Leu-GlulOBu'l-Asn-TyríBu'l-CysfTrtl-Asn-OBu'-trifluor-acetát kiindulási anyag előállítása 5,) Ddz-Ile-CysjTrQ-Ser-Leu-Ty^Bu^-Gln-Leu- GlutOBu'j-Asn-TyriBu'l-CysfTrtj-Asn-OBu' 22,8 g (14 millimól) H-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBu,)-Asn-TyríBu'j-CystTrtj-Asn-OBu'-t, 14,1 g (15,4 millimól) Ddz- Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH • 1 H20-t, 2,08 g (15,4 millimól) HOBt-t és 1,8 ml (14 millimól) N-etil-morfolint feloldunk 70 ml dimetil-formamidban és ehhez az oldathoz 0 C° hőmérsékleten hozzáadunk 3,4 g (16,4 millimól) DCC-t. A reakcióelegyet 0 C° hőmérsékleten 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük, éjszakán át állni hagyjuk, majd leszívatjuk a csapadékot. A szürletet vákuumban bepároljuk és a maradékot egymás után a következő oldatokkal dörzsöljük el, az egyes eldörzsölések között mindig leszívatjuk a terméket: nátrium-hidrogén-karbonát-oldat, pH = 3-as citrát-puffer-oldat, nátrium-hidrogén-karbonát-oldat és víz. Végül foszfor-pentoxid fölött szárítjuk. Kitermelés: 33,18 g (99%). A száraz terméket további tisztítás céljából 300 ml meleg etil-acetátban szuszpendáljuk és vízfürdőn rövid ideig melegítjük. 300 ml éter hozzáadása után még melegen leszívatjuk a kivált csapadékot, éterrel mossuk és nagyvákuumban szárítjuk. Kitermelés: 28,1 g (84%). Op: 265—270 C° (bomlás közben), [aß2 = —20,3° (c= 1, dimetil-formamidban). A kapott terméket még 100 ml metanolban hevítjük, majd éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk, leszívatjuk és szárítjuk. Kitermelés: 23,75 g (71%). [aß2=-25,4° (c = 1, dimetil-formamidban). Aminosav-analízis a C,2,,H,69N, 5025S2 összegképlet alapján (molekulasúly: 2394,0): Asp Ser Glu Cys Ile Leu Tyr számított: 2 l 2 2 1 2 2 talált: 2,10 0,95 1,77 0,49 0,83 2,10 1,98 b2 ) H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu’)-Gln-Leu-GluíOBu'j-Asn-TyríBu'j-CysGrtJ-Asn-OBu'-trifluor-acetát 24 g (mintegy 30 millimól) Ddz-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu‘)-Gln-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Bul)-Cys(Trt)-Asn-OBu‘-t feloldunk keverés közben 8,75 ml (100 millimól) trifluor-ecetsavból, 1,75 ml vízből és 165 ml metilén-kloridból ( = mintegy 175 ml 5%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsav, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
