180783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozinÓ1(inex lent) és/Asn2(index fölt)/-analógjai előállítására
19 180783 20 rációjú ammóniumacetát-oldatokat (pH 7,0, 0,025 mól, 0,25 mól), majd híg vizes ecetsav-oldatot használunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Amorf, fehér por formájában 0,281 g H,C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-GIu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t (timozin a],) kapunk. A fenti szintézissel előállított termék akrilamid-gélen végzett izoelektromos fókuszálás során a szarvasmarhathymusból elkülönített, természetes timozin a,-gyei azonosan vándorol [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 725 (1977)]. 2. példa 7,23 g (27,8 mmól) Boc-Ala-Ala-OH 200 ml metanol és 20 ml víz elegyével készített oldatához pH = 7,0 eléréséig 20%-os vizes Cs2C03-oldatot (kb. 30 ml) adunk, és a kapott, semleges kémhatású oldatot szárazra pároljuk. A maradékról 2x150 ml dimetilformamidot párolunk le. A kapott kocsonyás anyaghoz 120 ml dimetilformamidot és 7,2 g (42 mmól) benzilbromidot adunk, és az elegyet 15 órán át keverjük. Az oldószert lepároljuk, és a maradékhoz 500 ml vizet adunk. Az olaj formájában kivált termék állás közben lassan megszilárdul. A terméket 400 ml etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és sziruppá bepároljuk. A szirupszerű maradék petroléteres kezelés hatására kristályosodni kezd. A terméket etilacetátból és petroléterből átkristályosítjuk. 7,2 g (73,8%) Boc-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 71—73 C°. 6,0 g (17,15 mmól) Boc-Ala-Ala-OBzl-t 30 percig 380 ml frissen készített 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a szirupszerű maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. A maradék éteres kezelés hatására azonnal megszilárdul. A terméket metanolból és éterből átkristályosítjuk. 4,30 g (76,4%) HCI • H-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; [a]“ =-38,86“ (c = 1, metanol). 4,25 g (14,83 mmól) HC1 ■ H-Ala-Ala-OBzl 60 ml dimetilformamiddal készített, 0 C°-os oldatához 3,45 g (14,83 mmól) Boc-Asn-OH-t, 4,02 g (28,6 mmól) HOBT-t, 2 ml NMM-t és 3,37 g (16,35 mmól) DCC-t adunk, és az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 20 órán át 25 C°-on keverjük. Az enyhén lúgos kémhatás fenntartására az elegyhez időről időre NMM-t adunk. A kivált oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. Az olajos maradék vizes kezelés hatására azonnal megszilárdul. A szilárd anyagot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd a kristályosodás megindulásáig bepároljuk. A koncentrátumhoz azonos térfogatú petrolétert adunk, és az elegyet éjszakán át állni hagyjuk. A nyers terméket tetrahidrofuránból és petroléterből átkristályosítjuk. 5,2 g (75,6%) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 153—155 C“, [a]”=-55,61° (c = 1, metanol). 2,2 g (4,75 mmól) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl-t 30 percig 220 ml 4,0 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. A sav fölöslegét és az oldószert lepároljuk, és a maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradék éteres kezelés hatására megszilárdul. A szilárd anyagot friss éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott fehér, porszerű hidrokloridot (1,85 g) 40 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldathoz 0C“-on 1,97 g (4,75 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-OH DCHA-t adunk, és az elegyet 30 percig 0 C°on keverjük. Ekkor megindul a diciklohexilamin-hidroklorid kiválása. Az elegyhez 1,19 g HOBT-t és 1,08 g (5,23 mmól) DCC-t adunk, néhány csepp NMM-el pH = 7,5 értékre lúgosítjuk, és 2 órán át 0 C°-on, majd éjszakán át 25 C°-on keverjük. Az oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Enyhén színezett, szilárd maradékot kapunk. A maradékot vízzel és etilacetáttal alaposan mossuk, és a cserszínű, porszerű anyagot 40 ml dimetilformamidból és 500 ml izopropanolból kristályosítjuk. 1,57 g (56,9%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 213—215 C°, [a£5= -23,11° (c=I, DMSO). 1,57 g (2,69 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl 20 ml dimetilformamiddal készített oldatához 2 ml hidrazint adunk, és az elegyet 18 órán át keverjük. A kivált szilárd anyagot leszűrjük, és dimetilformamiddal, etanollal és éterrel alaposan mossuk. 1,22 g (89,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-AIa-AIa-HNNH2-t kapunk; op.: 262—264 C°, [a]” = — 26,7° (c — 1, DMSO). 0,698 g (0,358 mmól) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 30 percig 10 ml trifluorecetsavval kezelünk, és a peptidsót éterrel kicsapjuk. A sót vákuumszűrőn leszűijük, éterrel mossuk, és szárítjuk. 0,652 g (0,333 mmól) trifluorecetsavas sót kapunk. Egy külön reakcióedényben 0,17 g (0,335 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2-t 7 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz — 20C°-on 0,27 ml 6,18 n tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Az elegyhez 0,68 ml 10%-os dimetilformamidos izoamilnitritoldatot adunk, és a kapott oldatot 30 percig ugyanezen a hőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet — 30C“-ra hűtjük, és 0,234 ml (1,67 mmól) Et3N-t, majd 0,652 g, a fentiek szerint előállított dekapeptid-trifluoracetátot adunk hozzá. Az elegyet — 20 C°-on 3 ml dimetilszulfoxiddal hígítjuk, és néhány csepp Et3N-al pH = 7,5-re lúgosítjuk. A reakcióelegyet 30 percig - 20 C°-on, majd 5 napig 4 C°-on keverjük. Ezalatt az enyhén lúgos kémhatás fenntartására és a gélesedés megakadályozására 5 ml dimetilszulfoxidot és Et3N-t adunk. A kapott oldatot 250 ml 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált fehér csapadékot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd szárítjuk. A kapott 0,702 g nyers terméket (op.: 290—291 C°) dimetilszulfoxidos oldatából metanollal újból kicsapjuk. 0,348 g (42,0%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 296—298 C° (bomlás), [a]”= + 3,77° (c=l, DMSO). 0,866 g (0,373 mmól), a fentiek szerint kapott termék, 0,126 g (0,82 mmól) HOBT • H20, 8 ml dimetilszulfoxid és 6 ml dimetilformamid elegyét jéghűtés közben keverjük. Az elegyhez 0,085 g (0,411 mmól) DCC-t adunk, és 24 órán át 0 C°-on keverjük. Ezután az elegyhez 1,05 g (0,373 mmól), az 1. példa B. műveletsorozatának d) lépése szerint előállított tetradekapeptid-trifluoracetátot és 2 ml dimetilszulfoxidot adunk. Az elegyet néhány csepp NMM-el pH = 7,5—8,0 értékre lúgosítjuk, és 1 órán át 0 C°-on, majd 5 napig 25 C°-on keverjük. A reakcióelegyet az 1. példa B. műveletsorozatának d) lépésében közöltek szerint dolgozzuk fel. 1,5775 g védett oktakozapeptidet, azaz H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
