180746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 jelű antibiotikum előállítására
15 180746 16 Az A—21978.6 tenyészet különbözik a leírt törzstől a spórák nagyságában, a sárgarépa és a burgonyaszeleten való növekedésben, a nátrium-klorid toleranciában és a nitrát-redukcióban. Az A—21978 antibiotikumokat termelő Streptomyces roseosporus tenyészetet letétbe helyeztük a Northern Regional Research Center (U.S. Department of Agrikulture, Agrikultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604) törzsgyűjteményébe, ahonnan az NRRL 11379 számon megrendelhető. Ahogy az más mikroorganizmusok esetén is ismeretes, az A—21978 antibiotikumot termelő Streptomyces roseosporus NRRL 11379 tenyészet tulajdonságai variálnak. így például mesterséges variánsok és mutánsok állíthatók elő az NRRL 11379 törzsből különböző ismert mutagén ágensekkel, például ultraibolya sugarakkal, Röntgen-sugarakkal, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugarakkal és vegyszerekkel. A találmány szerinti eljárás során az A—21978 antibiotikumokat termelő Streptomyces roseosporus NRRL 11379 összes természetes és mesterséges variánsa és mutánsa használható. A Streptomyces roseosporus NRRL 11379 növesztésére több táptalajt használhatunk. A termelő gazdaságossága, az optimális hozam és a termék könnyű izolálása érdekében azonban előnyösen adott összetételű táptalajokat használunk. így például szénforrásként a nagytérfogatú fermentációkor előnyösen tápióka dextrint adagolunk, bár használható a glükóz, fruktóz, galaktóz, maltóz, mannóz, gyapotmag olaj, metil-oleát, glicerin, finomított szójabab olaj és más hasonló vegyüld is. Nitrogénforrásként előnyösen enzimesen hidrolizált kazeint, vagy oldódó húspeptont, szójabab lisztet, szójabab hidrolizátumot, szójadarát, élesztőt, aminosavat, például L-aszparagínt vagy DL-leucint vagy más hasonlókat használunk. A táptalajba adagolható szervetlen sók közül előnyösen használhatjuk az oldódó sókat, amelyek kálium-, ammonium-, klorid-, szulfát- vagy nitrát-ionokra vagy más hasonló ionokra disszociálnak. Az antibiotikum termelést különösen a kálium-szulfát segíti elő. Használhatunk melaszhamut, hamu dializátumot és szintetikus ásványi keveréket is. Az A—21978 antibiotikumok termelésekor előnyösen desztillált vagy ionmentes vizet használunk a táptalaj készítésekor. Egyes, a csapvízben levő sók, például a kalciumionok és a karbonátionok megzavarják az antibiotikum termelést. A mikroorganizmus növekedését és fejlődését elősegítő esszenciális nyomelemeket szintén be kell adnunk a táptalajba. Ezek a nyomelemek általában szennyezőanyagként jelen vannak a táptalaj többi alkatrészében, mégpedig a mikroorganizmus igényének megfelelő mennyiségben. A nagytérfogatú fermentációk táptalajába, ha a fellépő habzás problémát okoz, kis mennyiségű (például literenként 0,2 ml) habzásgátló anyagot, például polipropilén-glikolt adunk. Nagy mennyiségű A—21978 antibiotikum előállítására tankfermentációt végzünk süllyesztett, levegőztetett körülmények között. Kis mennyiségű A—21978 antibiotikumot előállíthatunk rázott tenyészetekben is. Az antibiotikum termelésben mutatkozó lag miatt a nagyméretű fermentort nem a mikroorganizmus spóráival, hanem vegetatív inokulumával oltjuk. A vegetatív inokulum előállítására kis térfogatú tenyésztő táptalajt a friss, aktívan növő mikroorganizmus spóráival vagy micélium darabkáival oltjuk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a nagy térfogatú fermentort. Az A—21978 antibiotikumokat termelő mikroorganizmus 20 C° és 30 C° közötti hőmérsékleten növekszik. A legtöbb A—21978C antibiotikum 30 C° és 32 C° közötti hőmérsékleten keletkezik. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációnál szokásos, a táptalajon steril levegőt vezetünk át. A legtöbb A—21978 antibiotikum akkor keletkezik, ha a táptalaj levegő telítettsége 20% felett van, előnyösen 30% felett (30 C° hőmérsékleten és 1 atm nyomáson). A tankfermentációkkor a fermentációs táptalaj pH- ját előnyösen 6,5 és 7,0 közötti értéken tartjuk. Ezt megfelelő mennyiségű például nátrium-hidroxid (a fermentáció korai fázisában) és hidrogén-klorid (a későbbi fázisban) adagolásával érhetjük el. Az A—21978 antibiotikumok termelését a fermentáció során kis minták analízisével követjük; a mintákat a fermentléből vagy a micélium tömeg extraktumából állítjuk elő az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmussal szembeni antibiotikum aktivitás méréshez. Egy ilyen méréshez használható mikroorganizmus a Micrococcus Iuteus. A biológiai értékmérést előnyösen agar lemezeken papírkorongos módszerrel végezzük. A termelés befejeződése után az A—21978 antibiotikumokat a fermentációs iparban ismert módszerekkel elkülönítjük a fermentléből. Az A—21978-at termelő mikroorganizmus által bioszintetizált antibiotikum általában a fermentlé folyadék fázisában található. Az A—21978 antibiotikumok maximális kinyerése érdekében ezért a micélium tömeg eltávolítására először szűrjük a fermentlevet. A szűrt levet az A—21978 keverék előállítására ezt követően különböző módszerekkel tisztítjuk. Előnyös módszer például az extrakció és az A—21978 keverék kicsapása. Az A—21978C keverék és az egyes A—21978 komponensek további tisztítását és elkülönítését adszorpciós és extrakciós lépésekkel végezzük. Az A—21978C keverék és az egyes komponensek tisztítására használható adszorptív anyagok például a következők : 1. Anioncserélő gyanták a) erősen bázikusak; polisztirol, Bio-Rad AGI és 2, Bio-Rex, Dowex 1 és 2, Amberlite IRA 400, 401,410; b) közepesen bázikus; epoxi-poliamin, Bio-Rex 5, Duolite A30B; c) enyhén bázikus; polisztirol vagy fenolos poharain Bio-Rad AG3, Duolite A—6, A—7, Amberlite IRA 68, IR—45, IR—4B; 2. Szilikagél ; 3. Florosil; 4. Polimer adszorbensek (XAD—2 és —4); 5. erősen porózus polimer (Diaion HP—20); 6. Sephadex G—10, G 25, G—50; Bio-Gel P—2 és P—10; 7. fordított fázisú gyanták, sziIikagél/Clg és szilikagél/C8; 8. aktív szén; 9. DEAE cellulóz, DEAE Sephadex; 10. poliamid; 11. alumíniumoxid; 12. mikrocellulóz. A fenti anyagokat a következő cégek árusítják: Bio- Rad és Bio-Gel gyanták: Bio Rád Laboratories Rich-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
