180566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tronin előállítására mikrobiológiai úton
7 180 566 8 közötti értékre állítjuk be. A fermentáció során a pH értéket automatikus pH-szabályozó segítségével, vizes ammóniaoldatot és glukózt tartalmazó oldat adagolásával tartjuk fenn. A fermentáció során bekövetkező pH csökkenés oka az, hogy a mikroorganizmus az ammóniát (nitrogént) fogyasztja. Tekintettel arra, hogy a nitrogén- és a glukózfogyasztás sebességének aránya közel állandó marad, ezt az arányt az ammóniát és glukózt tartalmazó oldat adagolásával kell fenntartani. Folyamatos levegőztetés és keverés mellett a mikroorganizmust 30—40 °C-on 40—50 órán át tenyésztjük. A fermentáció végén az L-treonin a 30 mg/1 értéket is elérő koncentrációban feldúsul. Az L-treonint az alábbiak szerint izoláljuk. A fermentléhez Falciumoxidot és ortofoszforsavat adunk, utána a biomasszát szeparálással vagy szűréssel elkülönítjük. Az oldatot — L- treonin-, kation- és pigment-tartalmától függően — so'rbakapcsolt kolonnák egész során vezetjük át. A kolonnák tartalmazhatnak például derítő adszorbenst a színezőanyagok megkötésére, H- formájú szulfokationcserélő gyantát a kationok és az L-treonin adszorbeálására. A szufokationcserélő oszlopról az L-treonint ammóniaoldattal eluáljuk. Az L-treonin fő tömegét tartalmazó frakciókat vákuumban bepároljuk, lehűtjük és az L-treonint kristályosítjuk. A kristályosodás meggyorsítására alkoholt adhatunk az oldathoz. A kapott termék 97—99% L-treonint tartalmaz. A hozam 80—95%. Járulékos átkristályosítás után a termék például szövetsejttenyésztéshez szükséges közegekben használható fel. Ha a tenyészlé treonin-tartajlma viszonylag magas (18 g/1 felett), a szennyező kísérőanyagok mennyisége pedig csekély ,az L-treonint abszorpciós lépések nélkül, közvetlenül ioncserélő gyantán is izolálhatjuk. A tisztított oldatot alacsony hőmérsékleten vákuumban betöményítjük, lehűtés után az L-treonint adott esetben etilalkohol hozzáadásával kristályosítjuk. A kapott terméket még egyszer átkristályosítva 99% tisztaságú terméket kapunk. A találmány szerinti eljárás hatékonysága az L-treonin szénhidrát-közeggel végzett előállítására irányuló ismert összes eljárásét felülmúlja. A tenyészlé treonin-tartalma a 30 g/1 értéket is eléri, ugyanakkor más aminosav nem szennyezi a közeget. A fermentáció időtartama 40 órára csökkenthető. A fermentáció során az L-treonin feldúsulásának átlagsebessége 0,75 g/l.óra, ami az ismert eljárásban mért feldúsulási átlagsebességnek ötszöröse. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa Az E. coli WNII Genetika M—1 termelő törzs oltóanyagát az alábbi összetételű agartáptalajfelületen 43 órán át tenyésztjük: Glukóz 5,0 g/1 NH4CI » 1,0 g/1 KH2PO4 1,5 g/1 NA2HPO4 3,5 g/1 MgS04.7H20 0,1 g/1 Penicillin 500 Mg/1 agar 20,0 g/1 víz ad 1000 ml A tápközeg pH értéke 7,0—7,2. A glukózt és a penicillint külön-külön sterilizáljuk, majd a folyósított közegbe (annak lehűtése és a ráoltás előtt) adagoljuk. A kapott tenyészetet steril vízzel leöblítjük, és a kapott sejtszuszpenzióval 0,5 liter térfogatú fermentáló edényt oltunk be. A kiindulási sejtkoncentráoió 106—107 sejt/ml. A fermentációs közeg összetétele az alábbi: (NH4)2S04 1,5 tf% K2HPO4 0,2 tf% MgSQj 0,04 tf% savval nye'rt élesztőhidrolizátum (élesztő szárazanyagra számítva) 0,3 t f% habzásgátló 0,1 t f % víz A tápközeget a készülékkel együtt sterilizáljuk, utána 2 tf% steril glukózt és 0,5 g/1 penicillint adunk a közeghez. A tenyészetet 35—37 °C-on fermentáljuk, közben az automatikus pH figyelő jelzésére 2,5— 2,7% ammóniát és 35% glukózt tartalmazó oldatot adagolunk a közegbe, a pH érték (7,0— 7,2) betartása céljából. 40 órás fermentáció után a tenyészlé 30 g/1 L-treonint tartalmaz. Az L- treonin feldúsulásának átlagos sebessége 0,75 g/1. óra. A glukózfelhasználás 6 g, 1 g L-treoninra vonatkoztatva. Ezt követően az L-treonint elkülönítjük. 300 g tenyészléhez keverés közben 3 g kalciumoxidot adunk, majd a folyadék pH értékét orto-foszforsavval 5,6-ra állítjuk. Az oldatot 60 °C-ra melegítjük, 10 percig állni hagyjuk, majd a biomasszát vákuumszűrővel elválasztjuk. A felülúszó részt (optikai sűrűség 0,4; 1 cm-es küvettában, 525 nm hullámhossz mellett) 50 ml derítő gyantát tartalmazó oszlopon át szűrjük. A derített oldat optikai sűrűsége 0,08. Az oldatot 150 ml H-formájú szulfokation-cserélő gyantát tartalmazó oszlopon keresztül engedjük. Utána az oszlopot 300 ml vízzel mossuk, majd az adszorbeált L-treonint 3%-os vizes ammónia-oldattal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban 25% szárazanyag-tartalomig betöményítjük, azonos térfogatú etilalkoholt adunk hozzá, és az elegyet 0 és +5 °C közötti hőmérsékleten 10 órán át állni hagyjuk. Az L-treonin-kristályokat leszűrjük, mossuk, majd szárítjuk, 8,1 g (90%) L-treonint kapunk. 10 mg terméket vékonyréteg-kromatográfiailag vizsgálva a kromatogramban más aminosavat nem észlelünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
