180484. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil, nagy mértékben immunogén, egy/vagy két jellemzőjében mutált, legyengített salmonella-baktérium mutánsok előállítására élő oltóanyagokhoz
11 180 484 12 közeg, de 20 gg/ml purin, illetőleg valamely más purinszármazék, például guanin, hipoxantin, xantin, inozin stb. hozzáadásával. 11) A puridependens mutánsok szelekciója : Egy húsfőzeten szaporított 16 órás rázott kultúra 5 ml-ét 45 ml húsfőzet-táptalajjal hígítjuk és 37 °C hőmérsékleten további 5 óra hosszat inkubáltatjuk. Centrifugálás és pufféról t fiziológiás nátrium-klorid-oldattal történő egyszeri mosás után az üledéket 7,9—7,4 pH-jú pufferolt fiziológiás nátrium-klorid-oldatban 108 csíra/ml koncentrációban szuszpendáljuk. Ebből a szuszpenzióból 10 ml mennyiséget 10 u.g/ml N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel kezeljük 5% túlélési arányig. A fenti módon lefolytatott mutagenezis után az anyagot 7,9—7,4 pH-jú pufferolt fiziológiás nátrium-klolid-oldattal kétszer mossuk, majd húsfőzet-táptalajjal 10 ml térfogatra feltöltjük és egy éjjelen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a fenotípus kifejlesztése céljából. Ezután a kultúrát újból centrifugáljuk, 7,9—7,4 pH-jú pufferolt fiziológiás nátlium-klorid-oldattal mossuk, és részben helyettesített minimál-tápközegben újból szuzspendáljuk 107—108 csíra koncentrációban; 37 °C hőmérsékleten 2 óra hosszat inkubáljuk, majd 400 NE/ml penicillint adunk hozzá és további 5—7 óra hosszat inkubáltatjuk 37 °C-on. Centrifugálás után az üledéket 7,9—7,4 pH-jú pufferolt fiziológiás nátrium-klorid-oldattal egyszer mossuk, majd pufferolt fiziológiás nátriumklorid-oldatban, 10 ml térfogatban újból szuszpendáljuk és logaritmikus hígítási sort készítünk. A 10°, 10-1, 10“2 és 10~3 hígításokból 0,1—0,1 ml mennyiséget ágár-lemez táptalajra viszünk, 37 °C hőmérsékleten történő 24 órai inkubáltatás után a kolóniákat az ágár-Iemezekről 20—100 kolóniaszámmal ágár-lemez táptalajra, minimál-táptalajia illetőleg részben helyettesített és teljesen helyettesített minimál-táptalajra visszük át. A teljesen helyettesített minimál-tápközegen fejlődő, de az egyszerű minimál-tápközegen és a részben helyettesített tápközegen fejlődést nem mutató kiónokat purin-dependenciájuk stabilitására vizsgáljuk. 1 1. példa Egyjellemzős mutánsok Olyan vadtörzsekből származó purin-dependens kiónok, amelyek laboratóriumi körülmények között nem adnak revertánsokat, illetőleg amelyek reverzió-gyakorisága < 10"8, stabil egyjellemzős oltótörzsként alkalmazhatók. 10° vadtörzs-csíra leválasztásának az elméleti lehetősége > 108 csíra oltóanyag-adagok esetén gyakorlatilag jelentéktelen, minthogy — az ilyen oltótörzseket annígyis Salmonella vadtól zsekkel fertőzött állatállományokban alkalmazzák, továbbá — az egyes ilyen csírák a populációs szinten biztonsággal kiküszöbölődnek. A fent leíit módszer esetében az ismertetett stabil egyjellemzős oltótörzseket kapjuk, amelyek a púi in-függőséget mutatják szaporodást nem gátló mutációs jellemzőként. A stabil egyjellemzős oltótörzseknek a legyengítés és az egér-modellen mutatott immunogenitás szempontjából lényeges specifikus adatait a II. táblázat és az ehhez fűzött megjegyzések tartalmazzák. A táblázat a stabil, purin-dependens egyjellemzős mutánsok legyengítését és imnninogenitását szemlélteti; a szaporodást nem gátló módon legyengített mutánsnak a prototrófiához (virulenciához) való reverziójának gyakorisága nagy mértékben szelektív laboratóriumi módszerekkel nem mutatható ki, illetőleg < 10-8. II. Táblázat Purin-dependens Salmonella mutáns immunogenitása i. p. immuni-Terhelés j- P-£ zálás 10* esi-100LD5o Salmonella-rával; +/30 LD 6gér vadmutánsok eger 20 nap után törzs 105 106 107 108 +/N egér dublin pur[ade]~16 IB 0 0 3 15 107’9 3/102 typhi-murium pur[ade]“81 0 0 9 22 107’5 3/89 cholerae-suis purfadej-j, 0 0 4 16 107’8 4/100 (+ : elhullott állat) (N: összes állat) Amint a II. táblázat adatai mutatják, a purin-dependens mutánsokkal (i. p. LD50 <108 csíra) lefolytatott kísérlet során az i. p. immunizálás következtében csupán egyes egetek hullanak el 107 csíra-szánt esetén ; az egyjellemzős purin-dependens mutánsokkal i. p. történő immunizálás eredményeképen az ímunizálást túlélő egerek legalább 95%-a mutatott teljes immunitást a >100 LD50 vadtörzs-adaggal való fertőzéssel szentben. Megjegyzendőnek látszik, hogy az ilyen öltőtől zsek általi szolid immunitást oly csíra-szám váltja ki, amelyet a kísérleti egér teljes mértékben el tud viselni és amely legalább két logaritmus-fokozattal van a toxikus fertőzés értéke alatt. Az oltótörzseknek az élő oltóanyag alkalmazása esetén szükséges és minden bakteriológiai laboratóriumban könnyen végrehajtható elválasztása a homolog vadtörzsekből a purin-jellemző kimutatása alapján történhet, amint ezt a III. táblázat mutatja : III. táblázat. Salmonella-törzs fejlődése A vizsgálandó Salmonella-törzs fejlődése teljesen helyetminimal-tap- tedtett minimál. közegben tápközegben oltótörzs 0 + vad t örzs + + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
