180431. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikum proteolitikus enzimek kimutatására
11 180 43 12 2. oldat 3-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol 33,8 g Aceton ad 100,0 ml Színtelen tesztcsíkot kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe bemártva világos türkiztől kékig színeződik, a leukocita tartalomtól függően. Az 1. példa receptúrájához képest a reakcióidő kissé rövidebb és valamivel élénkebbek a színek. Az 1. és 2. példa egyéb szubsztrátumaival és nedvesítőszerekkel, mint például a fent alkalmazott nonilfeníl-poliglikoléterrel (nemíonos), de például kókuszimidazolin-vegytiletekkel, [Miranol-CM conc. (Miranol Chem. Co. Amerikai Egyesült Allamok-beli cég készítménye)] (amfoter) is, vagy benziltrimetil-ammónium-kloriddal (kationaktív) vagy nátrium-szulfonát-dodecilbenzollal (anionaktív) is előállíthatunk olyan tesztcsíkokat, melyeknek az analóg, nedvesítőszert nem tartalmazó tesztpapírokhoz képest reakcióideje kis mértékben rövidebb, és a színek valamivel élénkebbek. 4. példa 1. oldat 3-[N-Benzoil-D,L-alaniloxid]-indol 154,2 mg Metanol ad 100,0 ml 2. oldat Dínátrium-tetraborát-dekahidrát 7,63 g Desztillált víz kb. 50 ml Az oldat pH-ját 1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be. Desztillált víz ad 100,0 ml Kémcsőben összekeverünk: az 1. oldatból 1 ml-t, a 2. oldatból 1 ml-t és a leukocita-tartalmú vizeletből 2 ml-t. A keverék a leukocita-koncentrációtól függően világos zöldtől mély kékig színeződik. Szobahőmérsékleten 10 percig hagyjuk állni, a leukocitakoncentrációt vizuálisan összehasonlító oldatokkal vagy fotometriásan például 620 nm-nél lehet meghatározni. A vizsgálat érzékenysége 200 leukocital/gl vizelet Az 1. és 2. példa egyéb szubsztrátumaival is lehet hasonló érzékenységű (200—1000/leukocita/pd vizelet) vizsgálatokat végezni, kémcsövekben vagy küvettában. 5. példa Egy tabletta, amelyben 3-[N-(4'-karboxi-metil-amino-benzol-szulfonil)-L-alaniloxi]-indol 2,0 mg kálium-dihidrogén-foszfát 0,8 mg dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát 16,8 mg mannit ad 70,0 mg van, 2 ml leukocitákat tartalmazó vizelethez adunk. A vizelet fokozatosan elszíneződik a leukocita-tartalomtól függően — világos zöldtől sötétkékig. A keveréket 10 percig állni hagyjuk szobahőmérsékleten, majd a leukocita-koncentrációt összehasonlító színsorozattal vizuálisan vagy fotometriásan, például 1 cm-es mikroküvettában 620 mn-nél meghatározzuk. 6 A vizsgálat érzékenysége körülbelül 200 leukocita/gl vizelet. A reakcióidőt lényegesen lerövidíthetjük, ha az inkubációt 37°C-on végezzük. Az 1. és 2. példában szereplő egyéb anyagokkal is hasonló érzékenységet (200—1000 leukocita/gl) érhetünk el, ajánlatos a nehezen oldódó anyagokhoz szerves oldószereket, például metanolt vagy dimetil-formamidot adni. 6. példa Szűrőpapírt (például Schleicher+ Schul 1 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impregnálunk, majd 60°C-on szárítjuk. 1. oldat Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 1,91 g Desztillált víz kb. 30 ml Az oldat pH-ját 0,1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be Desztillált víz ad 100,0 ml 2. oldat 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-tirozil-oxi]-indol 45,1 mg Aceton ad 100,0 ml Színtelen tesztpapírt kapunk, amely kimotripszin proteolitikus enzimet tartalmazó vizes oldatba mártva kékre színeződik. 0,02 E kimotripszin/ ml-es koncentrációt még 6—7 perc múlva is kimutathatunk. A megadott enzimaktivitást N-acetil-L-tirozinetilészterrel mint szubsztrátummal határoztuk meg 25°C-on, pH=7,0-nél és X=237 nm-nél. Az 1. és a 2. példa egyéb szubsztrátumaival — az aminosav-, illetőleg peptidcsoporttól függően — is kimutathatunk kimotripszint, vagy más proteolitikus enzimeket, például elasztázt vagy tripszint, vizes oldatokban, vagy például testnedvekben, például teljes vérben, szérumban, liquorban, pankreász-váladékban vagy a széklet vizes kivonatában. 7. példa 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alaniloxi]-indol 1. oldat A savkloridot egylépcsős módszerrel úgy állítjuk elő, hogy 5,35 g (0,022 mól) N-(toluol-4-szulfonil)-l-alanint 20 ml abszolút dimetil-formamidban (DMF) oldunk, és —30°C-ra hűtjük, majd keverés és hűtés közben 1,76 ml (0,024 mól) tionil-kloridot pipettázunk hozzá, és a reakcióelegyet 30 percen át —30°C-os hűtőfürdőben hagyjuk. 2. oldat Keverővel, hőmérővel és gázelvezetővel és -bevezetővel ellátott 250 ml-es háromnyakú lombikba — amelyből a levegőt teljes mértékben eltávolítót - tuk gyenge nitrogénáram segítségével — 2,90 g (0,022 mól) indoxil (3-hidroxi-indol) 40 ml abszolút dimetil-formamiddal készített oldatát töltjük, majd 9,74 ml abszolút piridint adunk hozzá, és —15°C-ra hű tjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
