180431. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikum proteolitikus enzimek kimutatására
21 180431 22 vékonyréteg-kromatográfiai kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-eeetsavas-etilészter 2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NHa (gáz), R,-értéke: 0,45). 10. példa 3-[N-(3',6'-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol A vegyes-anhidrid-eljáiás szerinti reakcióhoz 3,52 g (0,015 mól) N-(3,6-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alanint 35 ml abszolút tetrahidrofuránban oldunk. Az elegyhez 2,1 ml (0,015 mól) trietil-amint adunk, —15 °C-ra hűtjük, és a vegyes anhidrid előállításához 1,43 ml (0,015 mól) klórhangyasavas etil-észterrel elegyítjük. 1 órán át keverjük —15 °C- on, majd oxigén és víz kizárásával 2,00 g (0,015 mól) indoxil 20 ml tetrahidrofuránnal készített és —15 °C-ra lehűtött oldatát adjuk hozzá. Az elegyet további 2 órán át —15 °C és —20 °C közötti hőmérsékleten keverjük, és éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. A képződött trietilamin-hidrokloridot leszívatjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot a 7. példában ismertetett eljárás szerint feldolgozzuk. Az amorf, nyers terméket oszlop-kromatográfiásan kovasavgélen először metilénklorid — metanol 95:5 arányú elegyével, majd toluol — metil-etilketon 1:2 arányú elegyével tisztítjuk. Az összegyűjtött frakciókat aktív szénnel kezelve, az oldószer eltávolítása után 0,51 g (9,5%) színtelen viszkózus olajként 3-[N-(3',6'-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indolt kapunk. [a]®°: —40,4° (c = 1%, metanolban). Vékonyréteg-kromatográfia : előregyártott kovasavgél (futtatószer: toluol — metiletilketon 1:2 arányú elegye), értékelés ultraibolya fényben, NH3 (gáz), R, értéke : 0,54. Ezzel analóg módon állíthatjuk elő a megfelelően szubsztituált aminosavak és indoxil vegyületek reagáltatásával a következő termékeket : 10.1. 3-[N-(2'-nitro-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]indol, sárga kristályok, op. : 133—134 °C, [a]?,“: —116,0°, c = 1% (metanolban); 10.2. 3-[N-(l'-metil-2'-benzoil-vinil)-L-alanil-oxi]indol, halványpirosas kristályok, op.: 130—133 °C, vékonyréteg-kromatográfia : kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH3 (gáz), R,-értéke: 0,45). 11. példa A következőkben felsorolt, alaposan homogenizált filmréteg-masszát 100 um vastagságú rétegben visszük fel polikarbonát fóliára : 3%-os vizes nátrium-alginát-oldat 15 g poli(vinil-propionát) 16 g kovaföld 24 g kál ium-dihidrogén-f oszf át 0,2 g dinátrium-hidrogén-foszfát. 2HaO 4,2 g ionmentesített víz 35 g 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-aIanil-oxi]-indol 7,2 mg 10 ml etanollal készített oldata Az így rétegzett fóliát 50 °C-on szárítjuk és felvágjuk, ezt követően színtelen tesztcsíkokat kapunk, amelyek leukocita-tartalmú vizeletbe mártva — a leukocita koncentrációtól függően — világos türkisztől kékig színeződnek. A következő leukocita számot lehet kimutatni: 10 000 leukocita/ud vizelet kb. 8 perc múlva. 5 000 leukocita/ul vizelet kb. 15 perc múlva. A vizsgálat érzékenysége kb. 5000 leukocita/gl vizelet. Az 1. és 2. példa vegyiileteivel hasonló érzékenységet (5000—20 000 leukoeita/jd vizelet) lehet elérni. 12. példa A következőkben megadott oldatot 1 ml-es adagokban liofilezzük : 3-[N-(4'-karboxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol 155,4 mg poli(vinil-pirrolidon) 300 mg bórsav 618 mg ionmentesített víz körülbelül 50 nd az oldat pH-értékét n nátrium-hidroxid-oldattal 8,0-ra állítjuk be ionmentesített víz ad 100 ml A leukocita-koncentráció meghatározásához a liofilizátumot 2 ml leukocita tartalmú vizelettel elegyítjük. A vizelet elszíneződik — a leukocita koncentrációtól függően — világos zöldtől sötétkékig. Szobahőmérsékleten 10 percen át állni hagyj uk — néha rázogatjuk —- a leukocita koncentrációt vizuálisan összehasonlító színekkel vagy fotometriásan, például 1 cm mikro-küvettában 620 nm-nél. A vizsgálat érzékenysége 500 leukocita/gl vizelet. A reakcióidő lényegesen rövidebb, ha az elegyet 37 °C-on inkubáljuk. Az 1. és 2. példa többi vegyületeivel is hasonló érzékenységet (500—2000 leukocita/gl) lehet elérni, a nehezen oldódó vegyületeket szerves oldószerek, így például metanol vagy dimetil-formamid hozzáadásával növelni lehet. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Diagnosztikum proteolitikus enzimek kimutatására, amely szívóképes hordozóra itatott, filmrétegre felvitt, porkeverék-, liofilizátum-, oldat vagy reagenstabletta formájú, és egy vagy több kromogént, megfelelő pufferanyagot, valamint adott esetben szokásosan alkalmazott járulékos segédanyagokat tartalmaz, azzal jelemezve, hogy kromogénként I általános képletű indoxilés/vagy tioindoxil-aminosav-észtert és/vagy -peptid-észtert tartalmaz, ahol a képletben R1; R2, R3 és R4 jelentése azonos vagy eltérő, hidrogénatom, halogénatom, 1—4 szénatomszámú alkilcsoport vagy 1—4 szénatomszámú alkoxicsoport, X jelentése kénatom, vagy adott esetben 1—4 szénatomszámú alkilcsoportt|il, fenil- vagy naftilcsoporttal, fenil-vagy naftil-(l—4 szén5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
