180306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarkozin-oxidáz előállítására
180.306 Az enzim hőállóságát úgy határoztuk meg, hogy az enzimet tartalmazó (20 ug/ml protein) 0,5 ml, 10 mmólos, 8,0 pH-jú trisz- HC1 puffert különböző hőmérsékleteken 10 percig inkubáltuk. A vizsgálatra használt vegyület szarkozin volt. Amint a 4. ábrán látható, az enzim 40 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten stabil volt. (7) Molekulasúly Az enzim molekulasúlyát gélszűrési módszerrel meghatározva. 4o 000-nek találtuk. (8) Izoelektromos pont Ilórdozó-tipusú amfoter elektrolitét használó elektroforézissel meghatározva az izoelektromos pont 4,7. (9) A reakciótermék minőségi és mennyiségi meghatározása 1) Glicln azonosítása Reakoiókeverék: 0,2 mólós, 8,0 pH-jú trisz-HCl puffer 1 mmólos szarkozin oldat lcataláz szarkozin-oxidáz desztillált viz 1.0 ml 1.0 ml 200 egység 5 egység 8j0 ml 10,0 ml Ezt a 10 ml-nyi reakoiókeveréket 37 °C-on 60 percig irikubáltuk, majd 5 percig 100 °C-on való melegítéssel a reakciót megállapítottuk. A keletkezett csapadékot centrifugálással eltávolitottuk, és a felülúszó folyadékot tizedére bepároltuk. Ezt a bepárlási maradékot szűrőpapírra cseppentettük, és a kromatogramot éjjelen át vízzel telitett fenollal kifejlesztettük. A kromatogramot ninhidrin oldattal permetezve és melegítve szinreakoióval azonosítottuk a glioint. Rp-értéke 0,26, Összehasonlító mintaként hiteles szarkozin- és glicinmintákat használva, ezek Rp értéke 0,66, illetve 0,26 volt; következésképpen a fenti Rp-értéket mutató foltot glicinként azonosítottuk. ii) Formaldehid mennyiségi meghatározása Reakciókeverék: 0,2 mólós, 8,0 pH-jú trisz-HCl puffer alikvot konoentrációjú szarkozin kataláz szarkozin-oxidáz desztillált viz 0,05 ml 0,10 ml 200 egység 3,0 egység O^JLjgl___ 0,50 ml A reakciókeveréket 37 °C-on 20 percig inkubáltuk, majd a reakciót 5 percig tartó melegítéssel megszakítottuk, és lehűlés után 1,5 ml, 5,5 pH-jú acetát pufferoldatot, majd az aláb bi összetételű kromogén oldat 20 ml-ét adtuk hozzá. A kapott oldatot 37 oC-on 50 percig inkubáltuk, és 4l2 nm-nél kolorimetriásan mértük. Az eredményeket az 5. ábrán közöljük. Látható, hogy a termelt formaldehid mennyisége arányos a szarkozin koncentrációval. Kromogén: ammóniumacetát 15 g ecetsav 0,3 ml aoetilaoeton 0,2 ml vizzel kiegészítve 100 ml-re. iii) Hldrogénperoxid mennyiségi meghatározása A hidrogónperoxidot mennyiségileg a kombinált 4-aminoantipirin-fenol-peroxidáz módszerrel határoztuk meg. 7
