180285. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különböző poliszacharidéterek új aminoszármazékainak előállítására affinitáskromatográfia kárkészítés céljából

180.285

Az anyag feldolgozása az 5. példában leírtak szerint történik.

7. példa

Affinitás kromatográfiás eljárás patkány máj glükokortikoid receptorának tisztítására.

7.1. Az affinitásgél szintézisei

7.1.1. A gélre kötött szteroid ligand szintézise.

A szteroid ligandként használt 21-/4— karboxifenoxl/progeszteron /CPP/ szintézisét Failla et al. Írták le /1975/ Proo. Nátl .Acad.Tí ci .USA 72, 3849-3852/ oly módon, hogy kiinduló vegyületként deoxikortikoszteronból 21~klórprogeszteront készitettk. Módositva eljárásukat, először 21-jôdçrogeszteront szintetizáltunk, moly tetemesen nagyobb kitermeléssel nyerhető, mint a klóra zármazék és sokkal reaktívabb annál. így az ezt követő reakciólépésben keletkező 21-/4— karbonétoxiíenoxi/progeszteron szintézise az általuk megadott 8 óra helyett néhány perc alatt elvégezhető, és a kitermelés igen kedvező /80-84 %/» A további reakciólépéseket az általuk leirt módon végeztük.

7.1.2. A kar szintézise:

20 g leszivatva szárított Sepharose 2B~t /Pharmacia/

26 ml 0,5 M-os nátriumhldroxidban szuszpendálunk és 4- ml bisz^' oxlránnal rázatjuk 2 órát szobahőfokon. Az aktivált gél további feldolgozása a 2. példában leírtak szerint történik. Az aminocsoport tartalma 1,8 /umol per ml gél.

7.1.3» A kar és a szteroid ligand összekapcsolása.

162 mg GPP-t, 4-6 mg N-hidroxiszukcinimidet /MHS/ és 74 dg N,N*-diciklohexilkarbodiimidet 15 ml száraz dioxánban oldunk és egy éjszaka állni hagyjuk. Másnap a kivált N,N*~diciklohexilureát leszűrjük és 2 ml dioxánnal utánamossuk. Képződött a CPPHBS-észtere.

Az aminocsoportokat tartalmazó gélt átmossuk dioxán/viz /7*3/ elegyébe, majd 1 M-os NaHCO, oldattal pH 8-ra beállítjuk. Ezután beadagoljuk a CPP—NHS észterét és igy lassú kevertetés mellett elindítjuk a kapcsolási reakciót, időszakos pH ellenőrzés mellett. A reakcioelegyet 2 óra eltelte után üvegszürős Büchner tölcsérre öntjük és először dioxán/viz 1:1 elegyével, majd desztillált vízzel mossuk. Ez a származék olyan /VI/ képletü vegyületnek tekinthető, ahol M-OH agaróz és amelyben az__ aminocsoport egyik hidrogén atomját egy gyökkel helyettesítjük, mely a 21-es szénatomján'módosított deoxikortikoszteront tartalmaz funkciós csoportként.

7.1.4. A kapott gél utókezelése.

Az adszorbenst 1 M-os NaCl oldatban egy éjszaka állni hagyjuk, majd visszamérjük az elreagálatlan aminocsoportok menynyisegét. Ezután ezeket, ioncserélő hatásuk kiküszöbölésére acetilezzük 40 /ul ecetsavanhidriddel 0,1 M-oa foszfátpufferben, pH 7,5» Ezt követően a gélt erőteljesen mossuk 90 %—os nietanollal a nemkovalensen kötött szteroid eltávolítására. A kész adsz or benst 10 mM MES-t /pH 6,5/, 50 mM KF-ot, 0,5 mM EDTA—t tartalmazó puff erben tároljuk /B puffer/ 4-°C-on.

6