180149. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-(2,4-alkadien- 1-il)-2-hidroxi- metli3,4,5- trihidroxi- piperidin- származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
180149 szaharózt hasit percenként és ezzel egy-egy ,umol glükózt, amit a próba során meghatározunk, és fruktózt, ami't a próba során nem mérünk, tesz szabaddá. Az intesztinális diszaharidáz-komplexet sertés vékonybélmukozá-ból állítjuk elő, amit trlpszinnel emésztünk, 66 %-os alkohollal -20 °C-on kicsapunk, a csapadékot 100 mM-os foszfát-pufferben, pH 7,0, felvesszük és ezután ugyanazzal a pufferrel szemben dializáljuk. Egy próbaoldat 10 ul-ét. amelynek extinkciója legkevesebb 10 %-kal, de nem több , mint 25 %-kal különbözik a 100 %os értéktől, 0,1 M-os maleinát-pufferrel pH 6,25 hígított intés ztinália diszaharidáz-komplex 100 ,ul-ével elegyitjük és 57 °C-on 10 percen át előinkubáljuk. A diszaharidaz-komplex hígítását 0,1 SE/ml aktivitásra kell beállítani- Ezután 100 ul, 0.1 M-os maleinát-pufferrel pH 6.25 készített 0,4 M-os szaharozoldat /"SERVA" 55579/ hozzáadásával elindítjuk a reakciót és 20 perces inkubálás után 57 °0-on 1 ml glükÓz-aehidrogenáz-reagens /250 ml 0,5 M-os trisz-pufferben, pH 7,6 oldott 1 üveg liofilizált glükóz-dehidrogenáz-mutarotáz-keverék /MERCK 14055/ és 331,7 mg -nlkotinsavamid-adenin-dinukleotid /szabad sav, "BOEHRINGER" tisztasági fok I// hozzáadéisával leállítjuk. A glükóz kimutatásához 50 percen át 57 °C-on inkubáljuk a reakcióelegyet és 34-0 nm-en vakmintával szemben /csak szaharózt nem tartalmaz/ fotometráljuk. Az inhibitorhatas mértékének számítását megnehezíti, hogy a mérési rendszer csekély változása, például a meghatározásról meghatározásra kismértékben ingadozó 100 %-os értek, már nem elhanyagolható befolyást gyakorol az eredményre. Ezt a nehézséget úgy küszöböljük ki, hogy minden meghatározásnál egy standard-et is mérünk, a standard egy C25H45%8N összegképletü szaharázlnhibitor. amelynek fajlagos inhibitoraktivitása 77700 SIE/g és a mérésben 10 - 20 ng mennyiségben használva a fent megadott nagyságrendű gátlást eredményez. A 34-0 nm-en mért 100 %-os értéknek és a standard-del gátolt reakcióelegynek megfelelő extinkciók különbségének ismeretében ebből a különbségből a használt inhibitor mennyiségének figyelembevételével ismert módon kiszámítható a fajlagos lnhibitoraktivitás, szaharáz-inhlbitoregység/gramm-ban /SIE/g/ kifejezve. Előállítási példák 1. példa N-2,4-hexadién-l-il-l-dezoxinojirlmicin 1/1/ képletü vegyületj' 100 ml metanolban és 4,5 ml jégecetben oldott 5 S 1-dazoxinojirimioint 0 °C-on 4,4 mi 2,4-hexadienallal és 3 g nátrium-ciano-bór-hidrlddel elegyítünk. Egy órán át 0 °0-on, majd 18 órán át szobahőmérsékleten keverhetjük. Szárazra bepároljuk, a maradékot vízzel felvesszük és egy 120 om hosszú és 3,5 cm széles kromatográfiás oszlopra visszük. A stacioner fázis cellulóz, a mobil fázis aceton. Először acetonnal, majd fokozatosan 30 %-ig emelkedő víztartalmú acetonnal eluálunk. Az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográflásan vizsgáljuk, a kívánt terméket tartalmazókat egyesítjük és bepároljuk. Acetonos át kristályos itás után 4 g kívánt vegyületet kapunk, amelynek E^-értéke 0,55 /futtatószeri kloroform/metanol/vizes ammónia » 4*I3 * 1/» az 1—dezoxinoji— rimioin Ef_értéke 0,21. . Olvadáspont* 172 - 173 °0. 4
