180053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiai minták tejsav-tartalmának meghatározására fotometriás úton
3 ,180053 4 sára csak megszorításokkal alkalmazhatók. A biológiai minták a tej sav mellett számos olyan komponenst (például cukrokat, egyéb karbonsavakat, glicerint, hormonokat, vitaminokat, gyógyszer-metabolitokat stb.) is tartalmaznak, amelyeket a felhasznált oxidálószerek szintén aldehidekké oxidálnak, és az így képződött aldehidek — az acetaldehiddel azonosan — színreakciót adnak a felhasznált specifikus csoportreagenssel. Az idézett közlemények szerint a cukrokat előzetes kalciumhidroxidos adszorpcióval távolítják el a fehérjementesített biológiai mintából. Ez az eljárás körülményes, hosszú időt (több órát) vesz igénybe, és nem biztosítja az aldehiddé oxidálódó összes komponens tökéletes eltávolítását. Ezért abban az esetben, ha a tejsav meghatározására alkalmas ismert fotometriás módszereket biológiai minták tej savtartalmának mérésére használják fel, rendszerint ä minta tényleges fej sav-tartalmánál nagyobb tej sav-szintet mutatnak ki. Minthogy a tej sav mellett lévő egyéb, aldehiddé oxidálódó komponensek mennyisége ismeretlen, a pontos tej savtartalom korrekciós faktorok bevezetésével sem számítható ki. Szükség van tehát olyan eljárásra, amellyel a biológiai minták tejsav-tartalma szelektíven acetaldehiddé oxidálható, anélkül azonban, hogy a biológiai minták egyébé komponenseiből aldehid vagy a színreakciót zavaró más oxidációtermék képződne. Ezzel az eljárással a tejsav-meghatározás pontosságának fokozása mellett a zavaró komponensek előzetes eltávolítása is szükségtelenné válna, ami a vizsgálat jelentős egyszerűsödését eredményezi. Michalski és munkatársai (Talanta 5, 137 (I960) megállapították, hogy a kénsavas cérium(IV)szulfát perklórsavas közegben az aldohexózokst hangyasavvá, a ketohexózokat pedig hangyasavvá és széndioxiddá oxidálja. Smith és Duke (Ind. Eng. Chem. Anal. 15, 120 (1943) vizsgálatai szerint a kénsavas cérium(IV)-szulfát perklórsav jelenlétében csak a tejsavat oxidálja acetaldehiddé, más oxikarbonsavakból azonban nem képez aldehidet. Egyetlen közlemény sem foglalkozik azzal, hogy a biológiai minták egyéb komponensei (így a glicerin, továbbá a csekélyebb mennyiségű kísérőanyagok, például hormonok, vitaminok stb.) perklórsav jelenlétében cérium(IV)-szulfáttal oxidálva milyen oxidációtermékeket képeznek. A tejsav és a glicerin kémiai szerkezetét összehasonlítva reális az a feltételezés, hogy a cérium(IV)-szulfát a glicerin esetén is az egyik hidroxil-csoportot aldehiddé oxidálja. A nagy molekulasúlyú kísérő komponensek közül elsősorban a szteroidok azok, ame lyek oxidációjakor aldehid-képződésre kell számítanunk. Kísérleteink során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a kénsavas cérium(IV)-szulfát perklórsavas közegben a biológiai minták nagyszámú oxidációképes komponense közül szelektíven a tejsavat oxidálja aldehiddé, míg a többi komponensből sem aldehidet, sem a színreakciót zavaró egyéb oxidációterméket (például kelátot; nem képez. Abban az esetben tehát, ha a biológiai mintát perklórsavas közegben kénsavas cérium(IV)-szulfáttal oxidáljuk, olyan többkomponensű elegyet kapunk, amelynek kizárólag egyetlen komponense — a tejsawal ekvimoláris mennyiségű acetaldehid — reagál a specifikus színreagenssel. A találmány értelmében tehát a biológiai minták tej sav-tartalmát úgy határozzuk meg, hogy az előzetesen fehérjementesített biológiai mintát perklórsav jelenlétében az összes oxidálódó komponenssel legalább egyenértékű kénsavas cérium(IV)-szulfáttal kezeljük, a képződött acetaldehidet specifikus színreagenssel reagáltatjuk, a kapott minta extinkcióját meghatározzuk, és a mért értékből ismert módon kiszámítjuk a kiindulási minta tej sav-koncentrációját. A biológiai mintát bármilyen ismert módszerrel (például hőkoaguláltatással stb.) fehérjementesíthetjük. A fehérjementesítéshez azonban előnyösen perklórsavat használunk fel, mert a következő oxidációs lépésben szükség van a perklórsav jelenlétére. A perklórsavat rendszerint 0,5—1,5 mól/1 koncentrációjú oldat formájában adjuk a mintához. A fehérjementesített mintához ezután- kénsavas cérium(IV)-szulfátot adunk olyan mennyiségben, amely legalább egyenértékű a minta oxidációképes komponenseivel.'- A cérium(IV)-ionok jellegzetes sárga színének fennmaradása' jelzi azt, hogy a minta már nem tartalmaz oxidációképes komponenst. Az oxidációhoz reagens oldatként előnyösen 0,5 mólos vizes kénsav-oldattal készített 0,1 mólos cérium(IV)-ammóniumszulfát-oldatot használunk fel. Tájékoztatásként közöljük, hogy vér tejsav-tartalmának meghatározásakor rendszerint 0,1 ml, azonban 800 mg/dl-nél nagyobb vércukorszint vagy 200 mg/dl-nél nagyobb karbamid-N-szint esetén általában 0,2 ml szükséges a fenti reagens-oldatból a biztonságos oxidációhoz. Ha a minta a reagens-oldat beadagolását követő 10 perces állás közben elszíntelenedik, ez az oxidálószer elfogyását jelzi; ekkor 0,1 ml-es adagokban további reagens-oldatot adunk a mintához. Az oxidált mintában lévő, és a tejsavval pontosan egyenértékű mennyiségű acetaldehidet ezután a korábban idézett fotometriás módszerek bármelyikével meghatározhatjuk. A meghatározás módját és körülményeit az idézett közlemények részletesén ismertetik. Egy különösen előnyös módszer szerint az acetaldehidet oxalil-dihidraziddal és réz(II)ionokkal képezett kék színű komplexe formájában határozzuk meg. Ezt a módszert a szakirodalomban eddig még nem ismertették aldehidek mennyiségi meghatározására. Noh^ már korábban is ismert volt, hogy a réz(II)-ionok feleslegben vett oxalil-dihidraziddal aldehid jelenlétében élénk kék színű komplexet képeznek, és ez a reakció a réz(II)-ionok fotometriás kvantitatív meghatározására alkalmas (Velősy Gy. : Kandidátusi értekezés, 59. oldal (1974), a megelőző vizsgálatok nem mutatták ki, hogy ez a háromkomponensű színes komplex szigorúan 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
