180021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 20 alfa-hidroxi-metil-pregna-1,4-dién-3-on, 20 alfa-hidroxi-metil-pregn 4-én-3-on vagy ezek elegyének előállítására
11 180021 12 500 ml űrtartalmú lombikba 100 ml mennyiséget töltünk az oltóanyag tápközegből. A lombikot és annak tartalmát autoklávban sterilizáljuk 15 percen át 120 C hőmérsékleten. A közeget oltókacsnyi Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 kultúrával inokuláljuk és az inokulált közeget 72 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten vibrációs rázógépen, percenként 120 — 7 cm kitérésű — löketet alkalmazva. Tíz (10) 500 ml űrtartalmú rázólombik mindegyikébe 50 ml fő fermentációs tápközeget (pH 7,0) töltünk, melynek összetétele: 5% szójababolajos liszt 1,0% gyapotmag olaj 0,2% K2HPO„ 0,2% NaN03 0,1% MgS04.7 H20 0,8% koleszterin és a fennmaradó rész viz. A lombikokat és azok tartalmát autoklávban sterilizáljuk 20 percen át 120 °C hőmérsékleten. Mindegyik lombikot a fentiek szerint kapott oltóanyag tápközeg 2 ml-nyi mennyiségével inokuláljuk. A fő fermentációt 30 °C hőmérsékleten kezdjük vibrációs rázógépen, per- 20 cenként 120 — 7 cm kitérésű — löketet alkalmazva. Az inkubáiás kezdetétől számított 150 óra után leállítjuk az inkubálást. A kombinált fermentációs talajt 2 1 etil-acetáttal kétszer extraháljuk. Az oldhatatlan anyagokat, pl. sejteket kiszűrjük, az extraktum HPD-, illetve 4HP-tartalmát gázkromatográfiás elemzéssel határozzuk 5 meg. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja. Az extraktumot szilikagélen kromatografáljuk, 20%-os etil-acetát-n-hexánnal eluáljuk, így elkülönítjük a kapott HPD-t és 4HP-t, a koleszterin szubsztrátumot és a melléktermékeket. A HPD és 4HP frakciókat 10%-os etanol- 10 -heptánból való átkristályosítással tisztíthatjuk. A fent leírt inkubációt megismételjük azzal az eltéréssel, hogy a koleszterol szubsztrátum helyett alkalmazunk (2: 1 arányú) (3-szitoszterin és kampeszterin elegyet, koleszt-4-én-3-ont, koleszta-l,4-dién-3-ont vagy 15 koleszteril-oleátot. Az eredményeket ugyancsak mutatja a 3. táblázat. Összehasonlíthatóság céljából mindenkor mutatjuk azokat az eredményeket is, melyeket akkor kapunk, ha gyapotmagolajat nem adunk hozzá. Az alkalmazott gyapotmagolaj közel 100%-os gliceridelegy. Ez a további példákban alkalmazott olajokra szintén érvényes. 3.táblázat Szubsztrátum Hozzáadott Termék (g) Maradék szubsztrátum HPD 4HP szubsztrátum (g) koleszterin nincs 0,62 0,04 2,68 gyapotmagolaj 2,36 0,14 0,13 szitoszterin+kampeszterin nincs 0,43 0,03 3,12 gyapotmagolaj 1,63 0,08 0,45 koleszt-4-én-3 -on nincs 0,44 0,02 3,25 gyapotmagolaj 1,16 0,08 . 2,05 koleszta-l,4-dién-3-on nincs 0,57 0,01 3,05 gyapotmagolaj 1,89 0,03 0,65 koleszteril-oleát nincs 0,11 0,01 3,65 gyapotmagolaj 0,28 0,03 3,20 6. példa 45 Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy különféle glicerideket és olajokat adunk a fő fermentációs közeghez gyapotmagolaj helyett. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja. 50 4. táblázat Olaj HPD-hozam (g) 4HP-hozam (g) Nincs 0,62 0,04 Olívaolaj 2,15 0,13 Kukoricacsíraolaj 2,20 0,17 Rizskorpaolaj 2,18 0,13 Pálmaolaj 2,45 0,19 Kókuszdió olaj 2,35 0,13 Szójababolaj 2,36 0,14 Szezámolaj 2,15 0,12 Olaj HPD-hozam <g) 4HP-hozam (g) Földi mogyoró-olaj 2,09 0,12 Lenmagolaj 2,09 0,12 Szardíniaolaj 2,50 0,21 Háj 2,20 0,12 Triolein 2,09 0,12 Tripalmitin 2,33 0,13 cc-monosztearin 1,72 0,10 a,a'-disztearin 1,75 0,10 7. példa Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy az 1%-nyi gyapotmagolaj helyett trisztearint alkalmazunk különböző koncentrációkban. Az eredményeket az 5. táblázat mutatja: 6
