179965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására
9 179965 10 kagon-forrásul szolgáló proteint kapunk, amely 3,60 súly% glukagont tartalmaz. A használt, glukagon-tartalom megállapítására szolgáló, módszert Herbert és munkatársai által kidolgozott, inzulin-immunpróba, amelynél radioaktív hígítóoldatot és aktívszenet alkalmazunk [J. Clin. Endocr., 25, 1375 (1965)]. A glukagontisztaságot a jelenlevő glukagon súlysaként adjuk meg az összes szilárdanyagra vonatkoztatva. Az összes szilárdanyagtartalmat ismert módszerekkel határozzuk meg. Ezenkívül a glukagonkitermelést a glukagonforrásként szolgáló proteinben eredetileg jelen levő összes glukagonra vonatkozólag százalékban adjuk meg. 1. példa A) Az oszlopra viendő glukagon-oldat készítése 200 g glukagonforrásul szolgáló proteint feloldunk 5 liter 3,0 pH-jú vizes hidrogénklorid-oldatban. Az oldat pH-ját 3 n vizes nátriumhidroxid-oldattal körülbelül 11-re állítjuk be annak érdekében, hogy megkönnyítsük a protein oldódását, ezután pedig az oldat pH-ját 3 n vizes hidrogénklorid-oldattal 9,5-re csökkentjük. A kapott oldat szűréskor átlátszó lesz. A végső térfogat 5,675 liter. B) Első gél-szűrés Négy Pharmacia KS—370/15 egységből álló szelvényes kromatográfiás oszlopot megtöltünk Sephadex G—-50F-fel és 25 C°-on egyensúlyba hozzuk 9,5 pH- vizes ammóniumhidroxid-oldattal, amely 0,001 mól EDTA-t és 0,1 térfogat% butanolt tartalmaz. Az oszlopra viendő glukagon-oldattal megtöltjük az oszlopot és utána 9,5 pH-jú ammóniumhidroxid (EDTA) butanololdattal eluáljuk 300—400 ml/perc oldatsebesség mellett. A távozó folyadékban levő proteint ügy állapítjuk meg, hogy mérjük az eluálószer százalékos átvitelét 280 nmnél egy LKB Uvicord II abszorpcióméterrel. Miután 19,6 liter távozó folyadékot felfogtunk (a térfogat egyenlő az oszlop hézagtérfogatával), 22,4 liter mennyiségű frakciót gyűjtünk össze, amely nagy molekulasúlyú proteint tartalmaz. Ezután három további frakciót fogunk fel, amelyek a következők: (1) egy előfrakció, amely 2 liter eluálószerből áll, (2) egy glukagon-tartalmú eluálószer, amely 11 liter, és (3) utófrakció, amely 4 liter. A glukagon-tartalmú eluálószer pH-ját 3 n hidrogénklorid-oldattal 5,5-re állítjuk és éjszakán át állni hagyjuk 25 C°-on. Az eluátum térfogata 11,0 liter. Az eluátum 50,6 g összes szilárdanyagot tartalmaz, amely 4,6 mg/ml; a glukagon-tartalom pedig 6,058 g, amely 551 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság 11,97 százalék és a kitermelés 84,14 százalék egy 7,20 g glukagontartalmú protein glukagon-forrásra vonatkoztatva. C) Közbenső kristályosítás A fent kapott glukagon-tartalmú eluálószert keverjük és 60 C°-on melegítjük. A pH-t 3 n vizes hidrogénklorid-oldattal 5,0-re állítjuk be. Az oldatot ezután melegen szűrjük és a szűrletet 24 órára körülbelül 5 C°-on tartjuk a glukagon kristályosodásának elősegítésére és leülepedésére. Az anyalúgot előbb dekantálással és utána centrifugálással elválasztjuk a kristályos glukagontól. Az anyalúgot további felhasználásra felfogjuk. A kristályos glukagont 9,5-ös pH-jú vizes ammóniumhidroxid (EDTA) butanol-oldatban oldjuk és a keletkező oldatot szűrjük. Az oldat végső térfogata 1,65 liter és 6,27 g szilárdanyagot tartalmaz összesen, ami 3,8 mg/ml koncentrációnak felel meg. Az oldat glukagontartalma 3,82 gramm, amely 2,322 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság ekkor 61,1 százalék és a kitermelés 53,1 százalék. D) Második gél-szűrés Egy fent leírt kromatográfiás oszlophoz hasonló ötszelvényes oszlopot készítünk. A közbenső kristályosításnál kapott oldatot az oszlopra visszük és a B) műveletnél ismertetett 9,5 pH-jú vizes ammóniumhidroxid (EDTA) butanol-oldattal eluáljuk 500 ml/perc sebességgel. Az oszlop eluálását lényegében a B) pontban leírt módon végezzük. Ebben az esetben a glukagon-tartalmú eluálószer 14,0 liter. Ez a glukagontartalmú eluálószer összesen 5,6 g szilárdanyagot tartalmaz, amely 0,40 mg/mlnek felel meg. A glukagontartalom 3,40 g, amely 243 mcg/ml-nek felel meg. A glukagon-tisztaság 60,7 százalék, a kitermelés pedig 47,22 százalék. Megjegyezzük, hogy a különböző pH-beállítások miatt az eluálószer szervetlen sótartalma jelentősen megnőtt. Mivel a szervetlen sók Kd értéke megközelítőleg egyenlő a glukagon Kd értékével, ezeket a sókat nem távolítjuk el a glukagonból a gél-szűrésnél. Mivel a glukagon-tisztaság az összes szilárdanyagra vonatkozik, úgy tűnik, hogy a második gél-szűrés nem jelent tisztítást, de bizonyos nem glukagonproteinek elkülönítése mégis végbemegy. Meghatározott különbség akkor jelentkezne, illetve akkor mutatkozna javulás a glukagontisztaságban, ha a tisztaság nem az összes szilárdanyagra, hanem az összes proteinre vonatkozna. E) Végső glukagon-kristályosítás A második gél-szűrésből származó glukagon-tartalmú eluátum pH-ját 20 ml 10%-os vizes foszforsavval 7,5-re állítjuk be. A keletkező oldatot 5 C°-on 18 óra hosszat keverjük a glukagon lehető legnagyobb mérvű kristályosodása érdekében és utána 72 óra hosszat ülepedni hagyjuk a kristályos anyagot. Az anyalúgot dekantálással és centrifugálással elkülönítjük és felhasználásra félretesszük. A glukagon-kristályokat egymásután mossuk egyszer 0,001 százalékos sóoldattal, kétszer vízmentes alkohollal és egyszer vízmentes éterrel. A kristályokat ezután vákuumban éjszakán át szárítjuk. Az így kapott kristályos glukagon mennyisége 3,455 g. Aminosav-analízisen és kationcserélő kromatográfiás analízisen alapuló vizsgálatok szerint a kristályos glukagon tisztasága 91,1 százalék. Ennek megfelelően 3,13 g tiszta glukagont tartalmazó kristályos glukagon megfelel 43,5 százalékos kitermelésnek. 2. példa A) Glukagon-oldat készítése 144 g glukagont tartalmazó 4000 g protein glukagonforrást feloldunk 250 liter 2,8 pH-jú vizes hidrogén-5 10 15 20 25 30 35 10 15 50 55 60 65 5
