179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
9 179956 10 b) „Második antitest” előállítása (szamárból származó anti-birka immunglobulin) Stabil emulziót készítünk úgy, hogy 1 rész, Fc fragmentumot (0,75 mg/ml) és Bacillus Calmette-Guerin-t (BGG) (1,5 mg/ml) tartalmazó nátriumklorid-oldatot és 2 rész Marcol 52 adjuvánst (Freund-féle adjuváns származéka) keverünk. Az emulzióból hat intramuszkuláris injekciót (1 ml) adunk az állat alsó lábszárába. A szamárban ellenőrizzük anti-birka antitestek termelődését, 2 hónap múlva az állat kész az emlékeztető oltásra. A 2 rész adjuvánsból és 1 rész sóoldatból (0,75 mg/ml birka Fc) álló emulziót hat helyen (0,5 ml) im. beadjuk az állat alsó lábszáraiba. Az ezt követő 10 nappal és a következő hónapban vett vér magas antitesttiterű. c) Immunadszorbens készítése szamárból származó anti-birka immunglobulin tisztításához Sepharose 4B-t aktiválunk l,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal úgy, hogy a gél, a biszepoxid és 2 mg/ml nátriumbórhidridet tartalmazó 0,6 mólos nátriumhidroxid egyenlő térfogat-mennyiségeit folytonos keverés közben 25°-on 8 órán át inkubáljuk, majd mossuk. Birka IgG-t készítünk normál szérumkeverékből, 33%os ammóniumszulfáttal kicsapva. Az IgG-t 0,1 mólos, 10 pH-értékű nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben feloldjuk, és ezt az oldatot 10 mg birka IgG/ml gél menynyiségben az aktivált gélhez adjuk. Az aktivált gélt az IgG-vel 48 órán át inkubáljuk, az immunadszorbenst mossuk, és 24 órán át 0,1 mólos etanolaminnal, 10 pH- értéken kezeljük. d) Szamárból származó anti-birka „második antitest” tisztítása és jelzése A szamárból származó anti-birka immunglobulint úgy tisztítjuk, hogy a szamár anti-szérumot (készítését lásd fent) az immunadszorbenssel (előállítását lásd fent) inkubáljuk. Amíg az immunglobulint az immunadszorbens adszorbeálja, tiolcsoportokat építünk az immunglobulinba, az immunglobulin aminocsoportjainak módosításával. A módosításhoz metil-4-merkapto-butirimidát-HCl-t használunk. A módosítást úgy végezzük, hogy egy globulinmolekulára legfeljebb 3—5 tiolcsoport jusson. Az immunadszorbens-antitest komplexet mossuk, és 0,1 mólos N-etilmorfolin-hidrokloridban 7,5 pH-értéken szuszpendáljuk, úgy, hogy a koncentráció 1 ml immunadszorbens legyen 10 ml teljes térfogatban. Metil-4- -merkapto-butirimidát-hidrokloridot 0,2 mólos nátrium-karbonátban oldunk (10 mg/ml) közvetlenül a felhasználás előtt. Ebből az oldatból 0,1 ml-t adunk a szuszpenzió minden 10 ml-éhez. A szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd 10 ml pufferben 1 mg ditiotreitolt tartalmazó 0,1 mólos 7,5 pH-értékű N-etil-morfolin-hidro-kloriddal mossuk. A gélt ezután 0,1 mól nátrium-kloridot tartalmazó sósavval 3,5 pH- értékig alaposan átmossuk. Az ily módon előállított, beépített tiolcsoportokat tartalmazó immunglobulint (0,1 mól) nátrium-kloridot tartalmazó 2,5 pH-értékű sósavval eluáljuk. Ezt a legegyszerűbben úgy végezzük, hogy az immunadszorbenst kis oszlopba töltjük, és az eluátumot puffert tartalmazó kémcsövekbe gyűjtjük. Mivel az eljárás következő lépését 0,1 mólos acetát-pufferben végezzük 5,0 pH- értéken, az eluátumot elegendő 0,1 mólos 6 pH-értékű acetát-pufferben összegyűjteni, hogy a végső pH-érték 5,0 legyen. 2,5 mg, tiolcsoportokkal módosított immunglobulint tartalmazó, 2 ml 5,0 pH-értékű 0,1 mólos acetát-puffert jégfürdőben lehűtünk. Ezt az oldatot jégfürdőn lassan N,N'-o-fenilén-biszmaleimid 0,1 mólos 5,0 pH-értékű acetát-pufferrel készített telített oldatának 1 ml-éhez csepegtetjük. Ezután a keveréket 20 percig 30°-on inkubáljuk, majd az immunglobulint a feleslegben levő N,N'-o-fenilén-biszmaleimidtől elkülönítjük, úgy, hogy az oldatot G—25 Sephadex oszlopon (20x1,5 cm) folyatjuk át, amit előzetesen szobahőmérsékleten 0,01 mól magnézium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos 6,0 pH- értékű foszfát-pufferrel kiegyensúlyoztunk. Escherichia coli-ból származó, ammóniumszulfáttal kicsapott 5,0 mg [i-galaktozidázt feloldunk a tisztított aktivált immunglobulin-oldatban, és az oldatot 30°-on 4 órán át inkubáljuk. Az oldathoz annyi n nátriumhidroxid oldatot adunk, hogy a reakciókeverék pH- értékét 7,5-re beállítsuk, és annyi 2 mólos 2-merkapto-etanolt, hogy annak végső koncentrációja 10 mmól legyen. Az immunglobulin-enzim konjugátum oldatát DEAEAgarose (Biogel) oszlopra (60x0,9 cm) visszük, amit előzetesen 10 mmól 2-merkapto-etanolt, 10 mmól magnézium-kloridot és 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó, 10 mmólos 7,5 pH-értékű trisz.HCl pufferrel 4°-on kiegyensúlyoztunk. Az oldatot a kiegyensúlyozó oldattal bemossuk az oszlopba. 50 mmólos — 200 mmólos gradiensü, nátriumkloriddal gradiens-elúciót végzünk a fenti pufferben. A keverőedényekben 250 ml oldat van. Az enzimmel nem konjugált immunglobulin az oszlopon nem adszorbeálódik és eluálódik, mielőtt a gradienst alkalmaznánk. Amikor a gradienst alkalmazzuk, akkor az enzimmel jelzett immunglobulin eluálódik a szabad enzim előtt. Azt az eluált frakciót, amely a jelzett immunglobulint tartalmazza, liofilizáljuk, így kapjuk az enzimmel jelzett második antitestet a találmány szerinti eljáráshoz. 2. „Első antitest” előállítása a) Trijódtironin (T3) konjugátum előállítása 250 mg marha-szérumalbumint 25 ml desztillált vízben és 1000 mg l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimidet 50 ml desztillált vízben feloldunk. Mindkét oldatot lehűtjük 4°-ra, és a második oldat kétharmad részét lassan az első oldathoz keverjük. 150 mg tisztított trijódtironint etanol-2m ammónium-hidroxid 25 : 1 térfogatarányú keverékének 25 ml-ében feloldunk, és az oldatot 4°-ra lehűtve folytonos keverés mellett a fenti keverékhez csepegtetjük, 0,25 mólos sósav becsepegtetésével 7,0 pH-értéket tartva. A reakcióelegyet további 10 percig keverjük, és a maradék l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid-oldatot 7,0 pH-értéket tartva hozzácsepegtetj ük. A keveréket 4°-on éjszakán át keverjük. Reggel az oldatot centrifugáljuk, és a felülúszó részt 0,1 mólos, 11,0 pH-értékű nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonáttal szemben, három ízben, majd desztillált vízzel szemben dializáljuk. A terméket végül liofilizál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
