179770. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dns-polimeráz enzim szilárd hordozóhoz való kötésére és ennek alkalmazása polideazoxinukleotidok szintézisére
3 179770 4 enzim a reakcióelegyből egyszerű szűréssel eltávolítható és többször felhasználható. A találmány további alapja az a felismerés, hogy szilárd hordozóhoz rögzíthetők és így e célra felhasználhatók az olyan DNS-polimeráz enzimek, amelyeken olyan szabad merkapto-csoport van, amely nem része az enzim aktív centrumának. E csoportokon keresztül ugyanis az enzim a proton szubsztitúciójával alkalmas hordozóhoz köthető anélkül, hogy a rögzítés az aktivitás elvesztését vagy csökkenését okozná. Fentiek alapján a találmány eljárás polidezoxinukleotidok szintézisére2'-dezoxinukleozid-5'-trifoszfátokból aktív centrumához nem tartozó szabad merkaptocsoporttal rendelkező DNS-polimeráz enzimmel, kétértékű kation és adott esetben minta-láncindító komplex jelenlétében, az alkalmazott enzimnek megfelelő, 6,5 és 9,5 közötti pH-jú pufiferolt vizes közegben, 15 °C és 42,0 °C közötti hőmérsékleten. A találmány értelmében ügy járunk el, hogy a DNS-polimeráz enzimként merkaptocsoporttal kötés kialakítására képes szilárd hordozón kovalens kötéssel rögzített enzimet használunk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint szilárd hordozóként immobilizált, merkaptocsoportot tartalmazó reagenst használunk. Az enzim rögzítésére alkalmasak az olyan szilárd hordozók, amelyek merkaptocsoporttal kötés kialakítására képesek. Ilyenek a módosított agaróz bázisú immobilizált merkapto reagensek, például a Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia Information Booklet, 1977) vagy az Activated Thiol-Sepharose 4B (Pharmacia Information Booklet, 1974). A Thyopropyl-Sepharose 6B szerkezetét az 1. ábrán szemléltetjük, ahol a mátrix módosított agaróz. A Thiopropyl-Sepharose 6B 20 umól 2-tiopiridil csoportot tartalmaz 1 ml duzzasztott gélre vonatkoztatva, 1 g liofilezett gél pedig duzzasztva kb. 3 ml térfogatú. A 2-tiopiridil csoporttal védett és aktivált immobilizált merkaptocsoport különböző módokon szabaddá tehető, de diszulfid kötés kialakulása közben merkaptocsoporttal közvetlenül is reagáltatható. Az ilyenkor leszakadó 2-tiopiridon moláris extinkciós koefficiense 343 nm-nél 8,08 x 103 M 'cm'1. A kiválasztott szilárd hordozót kálium-foszfát pufferban (pH=7,4) duzzasztjuk, oszlopba töltjük, és felviszszük rá a pufferban oldott enzimet. A találmány értelmében olyan enzimet használunk, amely kémiai reakcióba vihető szabad merkaptocsoportot tartalmaz. Ilyen az Escherichia coli baktériumból izolálható DNS-polimeráz I típusú enzim (Kornbergpolimeráz). Ez alegység nélküli, 109 000 Dalton molekulasúlyú, 975 aminosavat tartalmazó szférikus molekula. Aktív centrumában többek között egy lizin és egy arginin molekula található. A molekulában egyetlen diszulfid kötés és egy merkaptocsoport van. Az utóbbi jódacetáttal és higanysókkal reagáltatható aktivitás csökkenés nélkül. Az E. colihoz hasonlóan más baktériumból izolált DNS-polimeráz I típusú enzimeket, így a Bacillus subtilis, a Micrococcus lisodeicticus és a Mycobacterium tuberculosis DNS-polimeráz I-et merkapto reagensek nem gátolják, tehát valószínűleg immobilizálhatók az E. coli enzimhez hasonlóan. Ugyanakkor a fenti baktériumokból izolált DNS-polimeráz II és III típusú enzimeket merkapto reagensek gátolják, ezért a fenti módon nem rögzíthetők szilárd hordozón. Az emlős szervezetekből eddig izolált DNS-polimerázok (EC. 2.7.7.7.) közül az a-polimeráz és a y-polimeráz szintén gátlódik, míg a ß-polimeräz nem gátlódik merkapto reagensek által. Az oszlopra felvitt, pufferben oldott enzimet további pufferrel belemossuk az oszlopba, és az elegyet q minél teljesebb rögzítődés érdekében tízszer cirkuláltatjuk perisztaltikus pumpával. A reakció az 1. reakcióvázlat szerint megy végbe, ahol E= DNS-polimeráz I enzim és R=Sepharose—O—CH2—CH—CH2—. I OH A rögzített enzim mennyisége közvetlenül a leszakadó 2-tiopiridon csoport fényelnyelésének mérésével, közvetve az enzim által katalizált szintézissel előállított DNS mennyiségének mérésével határozható meg. A rögzítési reakció befejezése után a puffért leengedjük, és a gélt további friss pufferrel mossuk, először addig, amíg az átfolyó puffer spektruma azonos nem lesz a tiszta pufferével, ez kb. 10 ml, majd további 40 ml-rel mossuk 1 ml/perc sebességgel. A spektrofotometriához Zeiss Spccord UV VIS regisztráló spektrofotométert használtunk. A fenti módon rögzített enzimet használjuk azután a polidezoxinukleotidok szintézisére. A szintézishez használt reakcióelegy vizes közegben tartalmazza a szubsztrátként alkalmazott dezoxinukleotidokaí és a mintaláncindító komplexet. A reakcióelegyet az alkalmazott enzim optimális működéséhez szükséges mennyiségű és minőségű pufferrel 6,5 és 9,5 közötti pH-értékre pufferoljuk. A reakcióelegyhez ezenkívül az enzim optimális működését biztosító fémsót, előnyösen magnéziumsót adunk megfelelő koncentrációban. Az oszlopot 37 ~C-ra temperáljuk, és felvisszük rá a szintén 37 °C-os reakcióelegyet, amelyet azután perisztaltikus pumpával cirkuláltatunk. A reakció előrehaladását különféleképpen ellenőrizhetjük, Így a savoldhatatlan anyag radioaktivitásának mérésével, papírkromatográfiával, végtermék analízissel vagy kontroll reakcióval. Radioaktivitás mérés esetén a reakcióelegynek jelzett szubsztrátot is kell tartalmaznia. Ehhez például [3H]dATP-t használhatunk. A mérést úgy végezzük, hogy az oszlopon átfolyó elegyből különböző időközökben 25 ul mintát veszünk Hamilton mikropipettával, és az aliquotokat GF/C jelű üvegszűrőkorongra (2,5 cm átmérőjű, Whatman) mérjük. Ezt hideg (0—5 °C) 5%-os triklór-ecetsav (TCA) és 1%-os nátrium-pirofoszfát oldat elegyébe dobjuk (10 ml oldat/db üvegszűrő, 0—5 CC, 10 perc), kétszer mossuk 5%-os TCA oldattal, majd kétszer 96%-os etilalkohollal, végül kétszer dietiléterrel, és levegőn szárítjuk. A savoldhatatlan polimer molekulák (10-nél nagyobb tagszámú polimer) radioaktivitását Packard spektrométerben mérjük toluolos koktélban. Ezzel a módszerrel követhető a kontroll reakció is. A papírkromatográfia radioaktív szubsztrátumokkal a reakció kvantitatív követésére, míg inaktív szubsztrátokkal a reakció kvalitatív követésére használható. 1 cmxl5—18 cm méretű DE 81 (DEAE-Cellulóz, Whatman) papírcsíkra 5—25 u.1 reakcióelegyet viszünk fel, és 0,15 mólos NH4HC03 oldattal futtatjuk: a nukleotidok Rf-je 0,35 és 0,55 között van, a polinukleotidok az alapvonalon maradnak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
