179727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmény előállítására
9 179727 10 (=U/CE): Us specifikus aktivitás, egység/mg enzim, USF: szabad állapotban észlelhető specifikus aktivitás, egység/mg enzim, f 100 x Us) Ureri relatív aktivitási = ------------1. 1 USF 1 1.táblázat Rögzített amiloglükozidáz Minta Aktivitási adatok száma D cE u us USF í.i. 1400 16,5 . 98,4 5,96 51 11,75 1.2. 9,0 100,5 11,16 95 2.1. 340 30,8 208,8 6,77 58 2.2. 17,4 203,9 11,71 100 3.1. 180 26,2 150,0 5,72 49 3.2. 12,7 149,5 11,77 100 4.1. 340 29,8 199,7 6,70 57 4.2. 17,9 209,4 11,70 100 10. példa Az 5—8. példában ismertetett 5.1., 5.2., 6.1., 6.2., 7.1., 7.2., 8.1. és 8.2. sz. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (glükóz-izomeráz) aktivitását Takasaki-módszerrel határoztuk meg [lásd Y. Takasaki: Agr. Biol. Chem. 30 (12), 1247—1253 (1966) és Z. Dische és E. Borenfreund: J. Biol. Chem. 192, 583 (1951)]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között 1 mgfruktózt képez. Az inkubálást a következő körülmények között végeztük : hőmérséklet : 65 C° ; reakcióidő : 1 óra ; szubsztrátum: 0,1 mól glükóz XH20-t (Merck 8342) és 0,0004 mól magnéziumszulfátot tartalmazó 0,05 mólos foszfátpuffer-oldat (pH=8,0). A hordozóra felvitt enzimkészítményeket a 9. példában ismertetett módon, standard körülmények között keverős reaktorban szuszpendáltuk. A készítmények fehérje-tartalmát a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján számítottuk ki. A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban közöljük. A 2. táblázatban feltüntetett rövidítések jelentése azonos a 9. példában közöltekkel. 2. táblázat Rögzített glükóz-izemeráz Minta száma Aktivitási adatok D cE u us urci USF 5.1. 1400 4,8 115,4 24,0 41 58,9 5.2. 2,0 117,3 58,7 99 6. 1. 340 22,0 558,5 25,4 43 6. 2. 10,2 556,1 54,5 93 7.1. 180 11,2 291,0 26,0 44 7.2. 5,1 292,3 57,3 97 8. 1. 340 21,3 543,2 25,5 43 8. 2. 9,8 544,0 55,5 94 A felsorolt adatok alapján a következőket állapíthatjuk meg: 1. A vizsgált minták aktivitása (U) maximumgörbe szerint változik ; a maximum helyzete a hordozóanyag 5 leggyakoribb pórusátmérőjétől függ. 2. A minták specifikus aktivitása (Us) az enzimfelvételtől függően változik, és meghatározott CE enzimkoncentráció esetén eléri az enzim szabad állapotban mért aktivitását (USF), azaz ebben az esetben Urel értéke IC 100%. E meghatározott enzimkoncentráció túllépésekor a minták specifikus aktivitása csökken, mimellett Us és CE szorzata állandó érték marad. 3. A hordozó által felvett enzimmennyiség a leggyakoribb pórusátmérő függvényében változik. Az enzimből 15 és hordozóanyagból kialakított rendszer maximális aktivitása a lehető legkisebb enzimkoncentráció alkalmazásakor jelentkezik ; ekkor az optimálisnak bizonyult, 340 Â leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező 2. hordozó grammonként 17,4 mg amiloglükozidázt (2.2. 20 minta), illetve grammonként 10,2 mg glükóz-izomerázt (6.2. minta) vesz fel. 4. A vizsgált minták enzimfeivéíele és aktivitása független az alkalmazott kapcsolószer minőségétől. Az enzimes műveletek gazdaságosságát jelentős mér-25 tékben befolyásolja a felhasznált enzim költsége, amely rendszerint eleve nagy, és a kívánt tisztasági fok növelésével igen nagy mértékben fokozódik. A találmány szerinti eljárás elsőként nyújt lehetőséget arra, hogy költséges enzimeket ipari méretekben is gazdaságosan alkal-30 mázhassunk, a találmány szerinti eljárással ugyanis a maximális aktivitás eléréséhez szükséges enzimmennyiséget optimális értékre állíthatjuk be. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények elöáliítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkal-40 más funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzim készítmények elkülönítése útján azzal jellemezve, hogy a leggyakoribb 45 pórusátmérőben egymástól különböző hordozókat az enzim-konccntrációban különböző enzim-oldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül 50 azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiségtől függetlenül a legnagyobb aktivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enz'm-oldatokkal hozzuk 55 érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapot- 60 ban mért fajlagos aktivitásához közel eső vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy hordozóanyagként nátriumoxidban kifejezve 0,1—0,5 súly% alkálitartalmú, szá-65 rított, majd 400—850 C°-os, előnyösen 570—750 C°-os 5
