179727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmény előállítására
3 179727 4 optimális póruseloszlásról és a felület nagyságáról azonban nagymértékben eltérő és ellentmondó adatok állnak rendelkezésünkre. Az alkalmazott felviteli módoktól függetlenül eddig még egyik ismert hordozóanyagon sem sikerült az enzimeket úgy immobilizálni, hogy azok specifikus aktivitása immobilizált állapotban megközelítse a szabad enzimek specifikus aktivitását. D. L. Latigue adatai szerint (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London, 1975, 127. oldal) a legkedvezőbb immobilizációs körülmények között is a hordozóanyagra felvitt enzim legföljebb 80%-a van aktív állapotban jelen. A találmány értelmében a vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására alkalmazott, önmagában ismert eljárást, amelynek során egy kovalens kötések kialakítására alkalmas, reakcióképes csoportokat hordozó szervetlen hordozóanyagot enzimoldattal hoznak érintkezésbe, oly módon kívánjuk tökéletesíteni, hogy minimális enzimfelhasználás mellett maximális aktivitással rendelkező enzimkészítményekhez jussunk. Találmányunk tárgya eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkalmas funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzimkészítmények elkülönítése útján, oly módon, hogy először a leggyakoribb pórusátmérőben különböző hordozókat az enzim-koncentrációban különböző enzimoldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiség ellenére a legnagyobb aktivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enzim-oldatokkal hozzuk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapotban mért fajlagos aktivitásához közeleső vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja. A találmány értelmében hordozóanyagként olyan leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező szervetlen anyagot alkalmazunk, amely a megkötött enzimmennyiségtől függetlenül maximális aktivitású enzimkészítményt szolgáltat, és ezt a hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely csupán annyi enzimet tartalmaz, hogy az így kialakult készítmény specifikus enzimaktivitása elérje vagy megközelítse az enzim szabad állapotban meghatározott specifikus aktivitását. A találmány szerint először különböző leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagokat ismert módon olyan kapcsolószerekkel kezelünk, amelyek egyrészt megfelelő szilárdsággal kapcsolódnak a hordozóanyaghoz, másrészt pedig alkalmasak arra, hogy az enzimmel kovalens kötést képezzenek. A kapcsolószert előnyösen kovalens kötés kialakításával rögzítjük a hordozóanyagon. E tekintetben különösen előnyösnek bizonyult a szervetlen hordozóanyagok szilánozása, kapcsolószerként azonban — miként már említettük — egyéb anyagokat is felhasználhatunk. A hordozóanyagnak kellően nagy számú kapcsoló tagot kell tartalmazni nia; a felvihető kapcsoló tagok száma nagymértékben függ a hordozóanyag felületi jellemzőitől. A fentiek szerint előkezelt hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel (azaz változó koncentrációjú enzimoldatokkal) hozzuk érintkezésbe, és az enzimet ismert módon, kovalens kötés kialakítása révén a kapcsoló tagokhoz (és ezzel a hordozóanyaghoz) rögzítjük. E kísérletsorozat végén meghatározzuk a kapott enzimkészítmények aktivitását. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimkészítmények aktivitása — a megkötött enzimmennyiségtől függetlenül — a leggyakoribb pórusátmérőtől függően változik, és az aktivitás/leggyakoribb pórusátmérő görbe maximumon megy keresztül. Az eredmények azt is igazolják, hogy a maximum helyzete független a hordozóanyag szemcseméretétől ; a hordozóanyag szemcsemérete csupán a maximum abszolút értékét befolyásolja. A hordozóanyag szemcsemérete tehát alárendelt jelentőségű tényező, és ténylegesen alkalmazandó értékét elsősorban egyéb körülmények, így az enzim felhasználási területe, a szubsztrátum viszkozitása, az eljárásmód és hasonlók szabják meg. A leggyakoribb pórusátmérő szempontjából értékelt és optimálisnak bizonyult hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel hozzuk érintkezésbe, és vizsgáljuk az enzimkoncentráció és az aktivitás összefüggését. E vizsgálatok alapján megállapítható, hogy meghatározott enzimkoncentrációk alkalmazásakor olyan enzimkészítményekhez jutunk, amelyek specifikus enzimaktivitása eléri vagy megközelíti az enzim szabad állapotban mért aktivitását, azaz relatív aktivitásuk 100% vagy ahhoz közel eső érték. A találmány értelmében optimális tulajdonságokkal rendelkező szilíciumdioxid-gél-alapú hordozóanyagokat alakíthatunk ki úgy, hogy a gél nátriumoxidban kifejezett és száraz anyagra vonatkoztatott alkálitartalmát 0,1—0,5 sú!y% értékre állítjuk be, a gélt szárítjuk, majd 400—850 C°-os, előnyösen 570—750 C°-os vízgőztartalmú levegőáramban 5—10 órán át hevítjük. A gélt előnyösen vízgőzzel telített levegőben, 180— 200 CJ-on szárítjuk. A gél hevítésekor célszerűen 40— 80% relatív nedvességtartalmú levegőáramot használunk fel. A fentiek szerint előállított hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérője 175 Â és 3000 Â közötti, előnyösen 250 Â és 600 Â közötti, kiemelkedően előnyösen 340 Â körüli érték. A találmány szerinti immobilizációs eljárást az összes technikai és analitikai szempontból jelentős enzim rögzítésére alkalmazhatjuk. A felhasználható enzimek közül példaként a következőket említjük meg: hidrolázok (így amilázok, glükozidázok és proteázok), oxidoreduktázok (így glükóz-oxidáz és kataláz), izomerázok (így glükóz-izomeráz) és transzferázok (így dextrán-szacharáz). Abban az esetben, ha enzimként szabad állapotban 10—15 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező amiloglükozidázt használunk fel, akkor jutunk optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítményekhez, ha az optimális leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 25—75 mg, előnyösen 50 mg amiloglükozidázt tartalmaz. Szabad állapotban 50—70 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező glükóz-izomeráz felhasználásakor úgy alakíthatunk ki optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítményeket, ha az optimális leggyakoribb 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
