179677. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-N-(omega-amino-alfa-hidroxi-alkanoil)-kanamicin-származékok előállítására
9 179677 10 általános képletű sav acilező származékának hidroxilcsoportjait megvédeni, például acilező származékok, mint savhalogenidek alkalmazásakor. A hidroxilcsoportot ismert módon, például karbobenzil-oxi-csoporttal, vagy acetilezéssel, szililezéssel és hasonlókkal védhetjük meg. Az acilezési reakció után az összes blokkoló csoportot önmagukban ismert eljárásokkal eltávolítva a kívánt 1 általános képletű vegyületekhez jutunk. A szililcsoportok például könnyen eltávolíthatók vízzel való hidrolízissel, előnyösen alacsony pH-nál. A II általános képletű sav acilező származékának B blokkoló csoportját és a poliszililezett kanamicin-kiindulóanyag 6'-aminocsoportjának blokkoló csoportját (ha van ilyen) szintén ismert módszerekkel eltávolítjuk. így például a terc-butoxi-karbonil-csoportot hangyasavval, a karbobenzil-oxi-csoportot katalitikus hidrogénezéssel, a 2-hidroxi-naftkarbonil-csoportot savas hidrolízissel, a triklór-etoxi-karbonil-csoportot jégecetben cinkporral kezelve, a ftaloiicsoportot etanolban, melegítés közben hidrazin-hidrátos kezeléssel távolíthatjuk el. A termék kitermelését különböző eljárásokkal határozzuk meg. Az összes blokkoló csoport eltávolítása és CG—50 (NH4+) oszlopon való kromatográfia után az amikacin kitermelését a kristályos szilárd anyagnak a megfelelő frakciókból való izolálásával vagy a frakciók mikrobiológiai vizsgálatával (turbidimetria, lemezöntés) határozzuk meg. Más használatos módszer a nem redukált acilezési keverék, azaz a szililcsoportok hidrolízise és a szerves oldószer eltávolítása után, de a maradék blokkoló csoport(ok) hidrogenolízissel való eltávolítása előtt kapott vizes oldat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiája. E vizsgálat nem közvetlenül a végtermék, hanem a megfelelő N-blokkolt vegyületek meghatározására irányul. A használt készülék „Waters Associates ALC/GPC 244” nagy nyomású folyadékkromatográf „Waters Associates Model 440” extinkció-detektorral és 30 cmx3,9 mm belső átmérőjű „jjt-Bondapak C—18” oszloppal, a következő körülmények alkalmazása mellett: Mozgó fázis 25% 2-propanol 75% 0,01 mól Na-acetát, pH 4,0 1 ml/perc UV, 254 nm-nél 0,04 AUFS dimetil-szulfoxid 5 [xl 10 mg/ml Folyási sebesség Detektor Érzékenység Hígító Befecskendezett mennyiség Koncentráció A diagrampapír sebessége változott, de jellemzően 1,25 cm per perc. A fenti körülmények között mennyiségileg könnyen mérhető csúcsokat adó UV-nyomokat kapunk. A fenti elemzések eredményeit a leírásban HPLC (nagy nyomású folyadékkromatográfia) vizsgálatként tüntetjük fel. A bonyolult kémiai nevek ismétlésének elkerülése céljából a leírásban gyakran a következő rövidítéseket alkalmazzuk : AHBA BHBA HONB L-(—)-amino-Y-hidroxi-vajsa v AHBA N-karbobenzil-oxi-származékai N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximid NAE BHBA N-hidroxi-5-norbornen(vagy BHBA-'-2,3-dikarboximid aktivált ONS') észtere DCC diciklohexil-karbodiimid 5 DCU diciklohexil-karbamid HMDS hexametil-diszilazán BSA bisz(trimetil-szilil)-acetamid MSA trimetil-szilil-acetamid TFA trifluor-acetil 10 terc-BOC terc-butil-oxi-karbonil „Dicalite” a Great Lakes Carbon Corporation diatomaföldjének márkaneve. „Amberiite CG—50” a Rohm és Haas Co. karboxíl-polimetakril-típusú, gyengén savas, kromatográfiás cé- 15 lókra szolgáló kationcserélő gyantájának márkaneve. „u-Bondapak” a Waters Associates nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oszlopainak márkaneve. Minden hőmérsékletet Celsius-fokokban adunk meg. A „kisszénatomszámú aikilcsoport” és a „kisszén- 20 atomszámú alkoxicsoport” 1—6 szénatomos aikil-, illetve alkoxicsoportokra vonatkozik. 1. példa 25 l-N-[L-(-=-)-Y-Amino-a-hidroxi-butiril]-kanamicin A (amikacin) előállítása po!i(trimetii-szili!)-6'-N-karbobenzil-oxi-kanamicin A szelektív acilezésével vízmentes dietil-ketonban 30 6'-N-Karbobenzil-oxi-kanamícin A-t (15 g, 24,24 miílimól) 90 ml vízmentes acetonitrílben szuszpendálunk és nitrogénatmoszférában visszafolyásig melegítjük. Lassan 30 perc alatt hcxametii-diszilazánt (17,5 g, 35 108,48 miílimól) adunk hozzá és a kapott oldatot 24 óráig visszafolyatás közben forraljuk. Az oldószert vákuumban (40°) lepárolva és a maradékot vákuumban (10 Hgmm) megszárítva 27,9 g fehér amorf szilárd anyagot kapunk (90,71% 6'-N-karbobenzil-oxi-kanamicin 40 A (szil ii)9-ként számítva). A szilárd anyagot 150 ml vízmentes dietil-ketonban oldjuk 23 '-on. 100 ml vízmentes dietil-ketonban feloldott L-(—)-Y-benzil-oxi-karbonil-amino-a-hidroxi-vajsav-N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximid-észtert 45 (NAE) adunk hozzá lassan, keverés körben 1/2 óra alatt, 233-on. Az oldatot 23°-on 78 óráig keverjük. A sárga, áttetsző oldatot (pH 7,0) 100 ml vízzel hígítjuk. A keverék pH-ját 2,8-ra állítjuk be (3n HC1) és 233-on. 15 percig élénken keverjük. A vizes fázist elválasztjuk és 50 a szerves réteget 50 ml 2,8 pH-jú vízzel extraháljuk. Az egyesített vizes frakciókat 50 ml etil-acetáttal mossuk. Az oldatot 500 ml-es Parrpalackba öntjük 5 g 5% Pd/C katalizátorral (Engelhard) együtt és 3,5 kg /cm2 nyomáson 2 óráig 23°-on redukáljuk. A keveréket 55 „Dicalite” diatómaföldön átszűrjük és további 30 ml vízzel mossuk. A színtelen szűrletet vákuumban (40— 45u) 50 ml-re bepároljuk. Az oldatot 5x100 cm-es CG—50(NH4+) ioncserélő oszlopra visszük fel. 1000 ml vízzel való mosás után nem reagált kanamicin A-t, 60 3-[L-(—)-Y-amino-a-hidroxi-butiril]-kanamicin A-t (BB—K29) és amikacint eluálunk 0,5n ammónium-hidroxid-oldattal. A poliacil-anyagot 3n ammónium-hidroxid-oídattal eluáljuk. Biológiai próbát, vékonyrétegkromatográfiát és optikai forgatóképesség-vizsgá- 65 latot használunk az elúció folyamatának követésére. 5
