179660. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászatilag hatásos mukopoliszacharid- polikénsavészter előállítására marha-tracheából
3 179660 7001 445, 7004 734 és 7314 078 sz. japán szabadalmi leírások (Derwent-számok : 04390 R, 06504 R, 14 519 R, illetőleg 25 548 U) szerint kondroitin-szulfátból (molekulasúly: 400—4000) klórszulfonsawal körülbelül 10 óra hosszat tartó kezeléssel (piridinben vagy formamidban), majd ezt követő meglúgosítás, vízgőzdesztilláció vagy kationcserélő gyantával való kezelés, illetőleg a kondroitin-poliszulfát kondroitinázzal történő depolimerizációja és szerves oldószerekkel való frakcionált lecsapás útján állítanak elő, ugyan nagy antilipémiás és ezzel együtt antiarterioszklerotikus hatást mutatnak, ízületi megbetegedések gyógykezelésére való alkalmasságuk azonban nem ismeretes. A találmány célja oly mukopoliszacharid-polikénsavészter előállítása volt, amely degeneratív ízületi megbetegedések gyógykezelése során közvetlenül injekcióban adható be az ízület-tokba. A találmány alapját képező feladat tehát oly eljárás kidolgozása volt, amellyel az ízületek által el nem viselhető poliszacharid- és protein-alkotórészektől mentes, nagytisztaságú mukopoliszacharid-polikénsavészter állítható elő. Azt találtuk, hogy gyógyászatiig hatásos és az ízületek által elviselhető készítmény oly módon állítható elő, hogy egy marha-tracheából extrakció útján ismert módon kapott nyers mukopoliszacharid-elegyből a zavaró nagyobbmolekulájú poliszacharid- és fehérje-részek elkülönítése céljából alkoholos frakcionálással egy mukopoliszacharid frakciót választunk el, előnyösen egy előfrakció 1—2 pH-értéknél, 20 °C hőmérsékleten, 30—34 tf.% etanol-koncentrációnál történő leválasztása és kiselejtezése, majd a kívánt mukopoliszacharid-frakció 70—74 tf.% etanol-koncentrációnál történő leválasztása útján, majd ez utóbbit a kisebb molekulájú alkotórészek elkülönítése céljából, részleges hidrolízis és szulfátészter-képzés után, 9—10 pH-értékű 5%-os vizes oldat alakjában, 5000 molekulasúly kizárási határú üreges rostokon vagy membránon, 20 °C hőmérsékleten dializáljuk, mi mellett a részleges hidrolízist sósavval, a szulfátészter-képzést pedig ismert módon klórszulfonsawal formamidban végezzük és a kapott terméket erősen savas kationcserélővei tisztítjuk és hidrogén-peroxiddal színtelenítjük. A fenti módon kapott mukopoliszacharid-polikénsavészter kéntartalma 11—13,5%, nitrogéntartalma 1,7—2,2%, urpnsavtartalma 20—26%, véralvadásgátló aktivitása (standard-heparinnal összehasonlítva) kisebb mint 15 NE/mg. A fenti módon előállított mukopoliszacharid-polikénsavészter nyulak hátsó végtagjának jobb térdízületébe, 0,2 ml 50 mg mukopoliszacharid-polikénsavészter/ml koncentrációjú oldat alakjában 12 alkalommal (hetenként 3 injekcióban) történő beadása esetén nem mutatkozott gyulladásos reakció az ízület-tokban. Embereknél, 50 mg/ml koncentrációjú oldat 10 alkalommal történő intfaartikuláris injekcióban való beadása során a készítmény jól elviselhetőnek bizonyult és jó hatást mutatott degeneratív térdízületi megbetegedések gyógykezelésében. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik : 1Ó kg friss marha-tracheát húsdarálóban felaprítunk és szobahőmérsékleten (20 °C-on) 35 liter acetonnal 3 óra hosszat keverjük, majd ezt a műveletet még kétszer megismételjük, minden alkalommal durva szűrőn átszűrve a szilárd részt. Az így kapott durvarostos trachea-port levegőn megszárítjuk. Hozam: 2,150 kg. 2 kg száraz trachea-port 600 g nátrium-hidroxiddal 15 liter vízben, 15 °C hőmérsékleten, időnkénti keveréssel 20 óra hosszat kezelünk feltárás céljából. Ezután az elegyet 3,9 liter 18%-os sósav hozzáadásával 1 pH- éitékre állítjuk be és centrifugáljuk. A kapott 16 liter tiszta folyadékot 48 liter etanollal elegyítjük és az elegyet 15 óra hosszat állni hagyjuk — 4 °C hőmérsékleten. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük, etanollal és acetonnal mossuk, majd vákuumexszikkátorban megszárítjuk. Hozam: 203,4 g nyers rr ukopoliszacharid-elegy. 200 g nyers mukopoliszacharid-elegyet 1800 ml vízben oldunk. Az oldat pH-értékét sósawal 1-re állítjuk be, majd vízzel 2000 ml térfogatra töltjük fel az o datot. Ehhez az oldathoz 20 °C hőmérsékleten 1000 ni 96%-os etanolt adunk és így egy előfrakciót választunk le. Az elegyet éjjelen át +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálással elkülönítjük és kiselejtezzük. A folyékony fázisból további 5000 ml etanol hozzáadása útján 4 °C hőmérsékleten egy mukopoliszacharid-frakciót választunk le, ezt centrifugálással elkülönítjük, majd etanollal és acetonnal mossuk. Hozam: 118,2 g mukopoliszacharidfrakció. A kapott mukopoliszacharid-frakció 100 g-ját 0,1 n sósavoldatban, 10%-os koncentrációban oldjuk, majd az oldatot 3 óra hosszat 80 °C hőmérsékleten tartjuk. 5'X)0 ml etanol hozzáadása útján leválasztjuk a részlegesen lebontott mukopoliszacharid-frakciót. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, etanollal és acetonnal mossuk. Hozam: 76,1 g. 75 g részlegesen lebontott mukopoliszacharid-frakciót 750 ml formamidban oldunk és egy szulfuráló lombikban, keverés és hűtés közben, 1 óra alatt 112,5 ml klórszujfonsavat csepegtetünk hozzá, miközben a reakcióejegy hőmérsékletét 10—15 °C-on tartjuk. Ezt követően a reakcióejegyet szobahőmérsékleten, (20 °C) még 4 óra hosszat tovább keverjük. A kapott oldatot 6 liter metanolba öntjük, amikor is a szulfatált mukopoliszacharid kicsapódik. A csapadékot leszívással szűrjük és 1500 ml vízben oldjuk. Az oldat pH-értékét nátrium-hidroxiddal 10-re állítjuk be, majd dializálás céljából az oldatot 3 óra alatt egy 5000 molekulasúly kizárási határú üreges rost patronon szivattyúzzuk keresztül, miközben a patron külső köpenyét eleinte áramló vízvezetéki vízzel, majd desztillált vízzel öblítjük. A dializált mukopoliszacharid-oldatot ugyanezen az üreges rost patronon keresztül történő ultraszűréssel 695 ml térfogatra koncentráljuk, majd 3500 etanol és nátrium-acetát hozzáadása útján leválasztjuk a szulfatált mukopoliszacharidot. Hozam: 75,8 g. 75 g fenti módon kapott mukopoljszacharid-polikénsivészter-frakciót 750 ml desztillált vízben oldunk, majd az oldatot 750 ml sztirol-divinilbenzol-kopolimerizátum-alapú erősen savas, gyűrűhöz kötött H+-alakú szulfonsav-csoportokat tartalmazó kationcserélő gyantán keresztül szűrjük. A szűrlet pH-értékét 4 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk be, majd 75 ml 30%-os hidrogén-peroxidot adunk hozzá és az elegyet 60 percig hagyjuk állni 70 °C hőmérsékleten, miközben a pH-értéket 10 percenként ismét 7,0-ra állítjuk be C,1 n nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával. Lehűlés után az oldatot 5000 ml etanolba öntjük, a termék le5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
