179655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon termelés fokozására
9 179655 10 2 térfogat// borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk 3,0 x10e sejt/ml koncentrációra. A sejteket interferon termelésre gerjesztjük oly módon, hogy 20 HAU/ml koncentrációban Sendaivírust adunk hozzá. A többi lombikban levő sejtmaszszát összegyűjtjük, 1000xg gyorsulás mellett 5 percig centrifugáljuk, majd nátrium-butirátot nem tartalmazó friss RPMI 1640 tenyészközegben 1,0 xlO6 sejt/ml koncentrációra ismét felszuszpendáljuk. A sejteket 50 ml-es mennyiségben szövettenyésztésre alkalmas, 75 cm2 hasznos területű 3 műanyag lombikban helyezzük, 36 °C-on inkubáljuk. Egymást követő napokon egy-egy lombikból származó sejtmasszát 1000 x g gyorsulással 5 percig centrifugálunk, majd 2 térfogat// borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben ismét felszuszpendáljuk 3,0xlO6 sejt/ml koncentrációra és az interferon termelést az előbbihez hasonló módon Sandai-vírussal megindítjuk. A kapott eredmények a VI. táblázatban láthatók. 8 VI. táblázat Butirátkoncentrácíó (mmól) Inkubációs napok száma nátrium-butirát jelenlétében További inkubálási idő butirát távol létébe Interferon koncentráció logio egység/ml Interferon hozam megaegységi liter 1. 0 0 0 4,05 íi 2. í 2 0 4,57 37 3. í 2 í 4,30 20 4. i 2 2 3,95 9 5. i 2 3 3,92 8 8. példa Interferon termelés nátrium-butiráttal kezelt Cercopitheus aethiop szürke majomvese V3 sejtvonal felhasználásával. Műanyag szövettenyésztő lombikba, amelynek sejtszaporodásra hasznos területe 25 cm2, V3 sejteket helyezünk [Cristofinis G. J,, J. Med. Micro., 3, (2), 251—258. o. 1970] 1,5 x10s sejt/ml koncentrációban 10 ml 4 térfogat % foetális borjúvérsavót tartalmazó Eagles-Basal közegbe. [Eagle H.: Proc. Soc. Exp. Bioi. and Med. 89, 362 (1955)]. A lombikokat 24 óra hosszat 36 °C-on inkubáljuk, így a sejtek a műanyagfelülethez tapadnak és elkülöníthetők. A tenyészközeget az egyes lombikokból eltávolítjuk és a sejtekhez 10 ml friss tenyészközeget adunk. Az egyik lombikba foszfátpufferes sóoldatban levő nátrium-butirátot adagolunk, hogy 2 mmól koncentráció alakuljon ki. Mindkét lombikot 36 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk. A tenyészközeget eltávolítjuk és az egyes tenyészeteket 2000 HAU/ml koncentrációjú, 0,5 ml Sendai-vírussal 5 beoltjuk. A lombikokat 36 °C-ra visszahelyezzük, így a vírus a sejtekkel egyesül. A beoltásra használt anyagot eltávolítjuk és a sejtrétegeket foszfátpufferes sóoldattal egyszer mossuk, majd 10 ml 2 térfogat// foetális borjúvérsavót tartalmazó Eagles-Basel közegben ismét szusz- 10 pendáljuk. A lombikokat 36 °C-on 24 óra hosszat inkubáljuk, majd a felülúszóból a nyers interferont izoláljuk. Az interferont tartalmazó közeget 2 pH-értéken a szokásos módon feldolgozzuk és mennyiségét mérjük. A kapott eredmények a VII. táblázatban lát- 15 hatók. VII. táblázat Interferon koncentráció (logio egység/ml) Interferon-hozam megaegység/liter 1. nátrium-butirát mentes V3 törzs 0,66 0,005 2. nátrium-butiráttal kezelt V3 törzs 1,32 0,021 30 9. példa Különböző gerjesztő anyagokkal kezelt, nátrium-butirátot tartalmazó Namalva/WRL sejtek interferon hozamának növelése. 35 Namalva/WRL sejteket kimerült tenyészközegből ülepítjük és 7 térfogat//, borjúvérsavót tartalmazó friss RPMI 1640 közegben 1,38 x10e sejt/ml koncentrációra ismét felszuszpendáljuk. 2 db 1 literes üvegedénybe 500 ml szuszpenziót helyezünk és az egyik 40 tenyészethez annyi foszfátpufferes sóoldatban levő nátrium-butirátot adunk, hogy 1 mmól legyen a végkoncentráció. A tenyészeteket 36 °C-on 48 óra hosszat keverjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük és 2 térfogat// borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 45 közegben 5,0 x 106 sejt/ml koncentrációra ismét szuszpendáljuk. A sejtkészítményekből 10 ml-es részmennyiségeket kiválasztott gerjesztő anyagokkal kezelünk. A vírussal kezelt tenyészetek felülúszóiból az interferon hozamot megvizsgáljuk a szokásos 2 pH-értéken tör- 50 ténő feldolgozás után. A kapott eredmények a VIII. táblázatból láthatók. VIII. táblázat Koncentráció Butiráttal előkezelt sejtek Interferon koncentráció logio egység/ml Interferon-hozam megaegység/liter 1. Sendai vírus 40 HAU/ml 3,71 5 2. Sendai vírus 40 HAU/ml 4-4,56 36 3. „Newcastle” betegség vírusa 20 HAU/ml — 2,45 0,3 4. „Newcastle” betegség vírusa 20 HAU/ml + 3,19 2 5. „Semliki Fofest” vírus 10 pfu*/cell — 0,72 0,005 6. „Semliki Forest” vírus 10 pfu*/cell + 1,22 0,02 5
